PUMA在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的功能与作用机制研究

Over 99% follicles undergo atresia during porcine ovary development. Granulosa cell apoptosis plays a critical role in this process. More than 60 proteins and signal molecules have been reported to be involved in granulosa cell apoptosis, while the key regulator remains unknown. PUMA is a BH3 only pro-apoptotic protein, and induces cell death in response to a wide variety of stimuli including genotoxic stress, growth factor deprivation,altered redox status, and infection. Our pilot experiment demonstrates that PUMA is upregulated in porcine granulosa cells. Therefore,we propose to investigate the role and molecular mechanism of PUMA in granulosa cell apoptosis during porcine ovary atresia in vivo and in vitro in the current study. First, the expression and localization of PUMA will be analyzed in both porcine ovary and granulosa cells; Second, the function and mechanism of PUMA will be explored in cultured porcine granulosa cells via over-expression and RNA interference mediated silence of PUMA; Third, the underlying mechanisms and regulatory pathways mediated by PUMA will be defined in both porcine ovary and granulosa cells; Fourth, the effects of small molecular PUMA inhibitors developed by the applicant on porcine ovary development and atresia in mice will be determined. The significance in the current study is to discover the key regulator in granulosa cell apoptosis during porcine ovary atresia, and develop a novel approach to control porcine ovary development and atresia using PUMA specific inhibitors.

在猪卵泡发育过程中，99%卵泡发生闭锁，卵泡颗粒细胞凋亡是其主要原因。迄今，至少发现60个蛋白或信号分子与颗粒细胞凋亡相关，但猪卵巢颗粒细胞凋亡的主要调控者仍不清楚。PUMA是一个只有BH3结构域的促凋亡蛋白，参与了DNA损伤、应激、感染等各种各样刺激诱导的细胞凋亡。申请者的前期研究证明PUMA在猪颗粒细胞凋亡过程中表达上调。本项目计划从体内和体外两个方面研究PUMA在猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中的功能和作用机制。首先，检测PUMA在猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡中的表达与定位；其次，通过在体外颗粒细胞中PUMA过表达或表达抑制研究其在颗粒细胞凋亡中的功能及其机制；再次，研究猪卵巢和颗粒细胞凋亡过程中PUMA表达的调控途径；最后，以小鼠为模型，研究申请者发现的PUMA抑制剂对卵巢发育与闭锁影响。项目研究有可能发现猪卵巢颗粒细胞凋亡的新型调控蛋白；并有可能发展干预卵巢卵泡发育与闭锁的新方法。

在卵泡发育过程中，99%卵泡发生闭锁，卵泡颗粒细胞凋亡是其主要原因，目前，发现了60多个蛋白和信号分子与颗粒细胞凋亡相关，但卵巢颗粒细胞凋亡的主要调控者还不清楚。PUMA是一个只有BH3结构域的促凋亡蛋白，参与了DNA损伤、应激等各种各样刺激诱导的细胞凋亡。.在本研究中，从体内和体外两方面研究PUMA在卵巢颗粒细胞凋亡过程中的功能和作用机制。首先，检测PUMA在卵泡颗粒细胞凋亡中的表达与定位；其次，通过过表达或抑制技术研究PUMA在卵巢颗粒细胞凋亡中的功能；再次，探索PUMA在卵巢颗粒细胞凋亡过程中的调控途径；最后，研究项目主持人发现的PUMA抑制剂对卵巢发育与闭锁的影响。.研究结果表明：在氧化应激条件下，PUMA在体外培养的卵巢颗粒细胞中表达上调；在体外培养的颗粒细胞中过表达PUMA，细胞凋亡显著增加（P<0.05）；相反，用PUMA抑制剂及其siRNA处理细胞，细胞凋亡则显著地减少。同时，PUMA表达降低。此外，Caspase3/8及Bim也在颗粒细胞中表达上调。.在氧化应激条件下，PUMA在小鼠卵巢体内表达上调；同时，Bim和Caspase3也表达上调；另外，用PUMA抑制剂注射到小鼠体内，细胞凋亡减少，同时小鼠存活时间延长。.重要的是，本研究进一步探讨了PUMA在卵巢闭锁过程中的调控途径。在体外培养的卵巢颗粒细胞中，过表达FoxO1，PUMA表达增加；相反，用siRNA抑制FoxO1表达， PUMA表达也减少；此外，抑制JNK表达，PUMA表达减少。同时，FoxO1从细胞质到细胞核的转移受到抑制。因此，本研究发现了JNK/FoxO1/PUMA通路在卵巢闭锁过程中的调控作用。.此外，在氧化应激条件下，PUMA基因敲除小鼠在转录组水平上的卵巢表达与未处理野生型小鼠的表达类似，再次证明PUMA是卵巢闭锁过程中的主要调控者。.综上所述，本研究通过体内和体外实验，我们发现了PUMA在卵巢颗粒细胞凋亡过程中的作用和调控机制，在转录组水平上证明了PUMA是卵巢闭锁的主要调控者，丰富了卵巢闭锁理论。同时，项目主持人发现的PUMA抑制剂为干预卵巢的发育与闭锁提供了新的途径，也为畜牧业的产仔数的提高提供了有效方法，同时，还为医学生殖障碍治疗提供理论依据。