阿维菌素结构修饰酶CYP107Z13电子传递途径研究

阿维菌素4"-羟基氧化为4"-羰基是甲氨基阿维菌素合成的关键步骤。目前化学氧化存在操作复杂、成本高、环境污染等问题，研究具有廉价、环保、位点专一的生物氧化对阿维菌素结构修饰有重要的理论和应用价值。项目组筛选到一株能位点特异性氧化阿维菌素4"-羟基生成4"-羰基的高效不吸水链霉菌ZB01，其中的阿维菌素结构修饰酶为CYP107Z13。该酶需要以特定的铁氧还蛋白（Fd）和铁氧还蛋白还原酶（FR）构成的电子传递途径提供电子才能实现催化功能。目前对该反应的电子传递途径还不清楚。因此本项目拟克隆ZB01的Fd和FR基因，分别异源表达和纯化，与CYP107Z13建立体外重组酶系统，确定CYP107Z13氧化阿维菌素反应的电子传递途径，阐明电子传递特性。为改进异源表达体系的CYP107Z13电子传递系统，提高阿维菌素生物转化效率奠定基础，并为其他CYP的研究利用提供指导。

阿维菌素4”-OH氧化为4”-O是甲氨基阿维菌素合成的关键步骤。化学氧化存在操作复杂、成本高、环境污染等问题，代之以廉价、环保、位点专一的生物氧化对阿维菌素结构修饰有重要的理论和应用价值。项目组筛选到一株能位点特异性催化氧化阿维菌素4”-羟基生成4”-羰基的高效链霉菌ZB01，其中催化该反应的酶为CYP107Z13。研究该反应的电子传递途径，对提高催化反应效率有重要的意义。本项目从不吸水链霉菌ZB01中克隆到一种铁氧还蛋白基因fd 1（Genbank No.KC147630），两种铁氧还蛋白还原酶基因fre1（Genbank No. KC147631）和fre2（Genbank No. KC510106）。采用同源单交换方法，破坏ZB01中的Fd 1基因，获得的Fd1基因破坏突变株不能转化阿维菌素生成4”-O-阿维菌素，显示FD1是ZB01中CYP107Z13转化阿维菌素反应的关键电子传递蛋白。采用E.coli表达系统分别异源表达和纯化了Fre1和Fre2表达蛋白，检测了FRE1和FRE2纯化蛋白的光谱学特性和电子传递特性，显示FRE1和FRE2都具有典型的铁氧还蛋白光吸收峰，均能够接受NADH和NADPH传递的电子，但对NADH的选择性高于NADPH。为研究FRE1和FRE2是否参与CYP107Z13催化阿维菌素反应，分别构建了Fd 1/Fre 2和Fd 1/Fre 1共表达载体，并分别与cyp107z13表达载体共转化E.coli BL21（DE3），获得2个全细胞生物催化系统，同时表达CYP107Z13、FD 1和FRE1的E.coli-zfr1和共表达CYP107Z13、FD 1和FRE2的E. coli-zfr2，HPLC检测E.coli-zfr1和E. coli-zfr2均具有转化阿维菌素生成4”-O-阿维菌素的功能，其中E. coli-zfr2的转化效率高于E. coli-zfr1。根据上述研究结果，推测ZB01中存在如下电子传递途径：NADH→FRE2（FRE1）→FD1→CYP107Z13→阿维菌素。其中，来自NADH的电子优先传递给FRE2，本研究为改进CYP107Z13电子传递效率，提高阿维菌素生物转化效率奠定了基础，并为其他CYP的研究利用提供指导。本项目研究发表SCI文章1篇。