卵泡期中后段猪卵巢组织miRNA分离及梅山与杜洛克猪卵泡间差异表达miRNA的鉴定

排卵数是窝产仔数的第一个决定因素。高排卵数与低排卵数品种母猪的排卵数差异源于卵泡期中后段其卵泡发育动力学的差异，前者的卵泡选择时段延长并产生更多排卵前卵泡。卵泡选择和成熟的动态变化受高度同步、精确的基因表达调控。鉴于miRNA具有重要而广泛的基因表达调控功能和对卵巢与雌性生殖细胞正常发育的决定性作用，梅山与杜洛克母猪在排卵数上的差异可能受其卵泡中miRNA表达差异的影响。本项目拟以卵泡期中后段两猪种卵巢组织为材料构建小RNA 文库，测定miRNA序列，鉴定新miRNA；分析其时空表达模式；筛选卵泡期中后段在梅山与杜洛克母猪中等卵泡M1（直径3.0mm-4.9mm）之间、中等卵泡M2（直径5.0mm-6.9mm）之间差异表达的miRNA；分析其靶基因表达规律，确定参与卵巢组织发育与功能维持的miRNA，为深入研究miRNA影响猪卵泡发育和动物繁殖数量控制的分子机理奠定基础。

排卵数是窝产仔数的第一个决定因素。高排卵数与低排卵数品种母猪的排卵数差异源于其在卵泡期中后段的卵泡发育动力学差异，前者的卵泡选择时段延长并产生更多排卵前卵泡。卵泡选择和成熟的动态变化受高度同步、精确的基因表达调控。鉴于miRNA具有重要而广泛的基因表达调控功能和对卵巢与雌性生殖细胞正常发育的决定性作用，梅山与杜洛克母猪在排卵数上的差异可能受其卵泡中miRNA表达差异的影响。本研究采集卵泡期第4天的猪卵巢，构建猪卵巢组织miRNA库并进行高通量测序，检测到272个已知的猪miRNA，获得到125个与其他物种已有miRNA同源的新miRNA，获得49个在其他物种尚未报道的全新miRNA，并对新发现的miRNAs进行了验证。利用miRNA芯片筛选在梅山与杜洛克母猪中等卵泡M2（直径5.0mm-6.9mm）之间、中等卵泡M1（直径3.0mm-4.9mm）之间的差异表达的miRNA。在M2卵泡中共检测到158个猪miRNA的表达，其中ssc-miR-30a、ssc-miR-708、ssc-miR-187、ssc-miR-486表达差异较大且达到显著水平，同时检测到22个在猪中未报道的miRNA表达差异较大且达到（极）显著水平。在M1卵泡中共检测到189个猪miRNA的表达，其中ssc-miR-363、ssc-miR-424-star、ssc-miR-92b、ssc-miR-335、ssc-miR-504、ssc-miR-152的表达差异较大且达到显著水平，同时检测到12个在猪中未报道的miRNA表达差异较大且达到显著或极显著水平。还对差异表达miRNA和重要靶基因的时空表达规律进行了分析。构建mir-184过表达载体分析其对CART的表达调控研究，结果表明在表达mir-184的Hela细胞中荧光素酶活性大幅下降，说明mir-184通过与CART基因3’-UTR结合来抑制其蛋白质合成，调控其表达。本研究发现了在猪卵巢中表达的miRNA，鉴定了在梅山与杜洛克猪M2卵泡之间和M1卵泡之间差异表达的miRNA，并对部分miRNAs的表达规律和其对重要靶基因的调控进行了研究，为深入揭示miRNA影响猪卵泡发育和动物繁殖数量控制的分子机理奠定基础。