let-7家族miRNA调控猪卵泡闭锁的分子机制研究

哺乳动物中，仅有极少数卵泡发育成熟并排卵，绝大部分卵泡（70%-99%）在发育过程中退化，最终被机体清除，这一过程称之为卵泡闭锁。目前的研究认为卵泡闭锁的本质是颗粒细胞的凋亡。本项目主要研究在猪卵泡闭锁过程中，let-7家族miRNA对卵巢颗粒细胞凋亡调控的分子机理。主要内容包括猪let-7基因结构分析；猪卵泡闭锁过程中let-7家族miRNA表达活性的变化；let-7靶基因的确定；let-7生物学功能的验证；综合分析let-7调控猪卵泡闭锁的分子机制。从而达到阐明let-7调控猪卵泡闭锁的分子机制的目标，重点解决let-7是通过何种机制来调控卵泡闭锁过程中颗粒细胞凋亡的问题。本项目的研究结果是对繁殖生物学的有益补充，为研究生殖相关基因的RNA 调控途径提供新的思路和有益的线索，对人工干预卵泡发育进程，提高优良母畜繁殖力，阐明某些与排卵障碍有关疾病的机理以及不孕症的治疗具有重要的指导意义。

课题组采用miRNA芯片技术发现，猪健康与闭锁卵泡let-7 microRNA家族的表达水平存在显著差异。本课题试图在验证此研究结果的基础上，深入研究let-7 microRNA表达差异调控猪卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的分子机制。通过优化引物设计，试验成功实现了let-7 家族各成员间的区分，采用实时定量PCR技术检测发现，与健康卵泡相比，早期闭锁与闭锁卵泡let-7a、let-7b、let-7c和let-7i的表达水平显著降低，而let-7g在猪卵泡闭锁过程中显著升高；试验结果与前期芯片结果一致。进一步的研究发现，体外培养的猪卵泡颗粒细胞过表达let-7g microRNA后，细胞的凋亡显著增加；凋亡相关基因CASP3、BAX和BIM的表达水平上升明显，而抗凋亡基因BCL-2 和MCL-1显著下调；并且检测到转录因子FoxO1表达上调与去磷酸化后的入核。在此基础上，采用生物信息学手段，在let-7g下游靶基因中筛选到与FoxO1磷酸化相关的候选基因MAP3K1，试验发现，颗粒细胞中let-7g过表达抑制了MAP3K1的表达，荧光素报告系统的试验进一步证实，MAP3K1是let-7g的靶基因，采用RNAi技术抑制猪颗粒细胞中MAP3K1表达后细胞的凋亡率显著下降。综上，猪卵泡颗粒细胞中let-7g表达上调抑制了下游靶基因MAP3K1的表达，从而上调FoxO1表达与去磷酸化水平，FoxO1入核诱导凋亡相关基因的表达，促进了卵泡颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁。