基质细胞p85突变在乳腺肿瘤血管生成中的作用研究

Breast cancer is one of the serious diseases all over the world and it is largely harmful for the health of female patients in our country. However, the molecular mechanism of breast cancer is still not fully understood. There are evidences that the signaling communication between breast stromal-endothelial interactions play a role in breast cancer development. PI3K pathway is the center point of the various cells signaling network. Clinical statistics indicates there are about 30% patients who have breast cancer with a mutation of their PI3K gene, especially its subunit p85α. However, the meaning of this mutation for the tumor angiogenesis and development is still unknown. This study will focus on the relations of stromal-endothelial interaction, investigate the role of the breast stromal cells p85α mutation on effects of the angiogenesis of the edothelail cells. In previous studies, we have found that condition medium of MEF (murine embryonic fibroblasts) p85α mutated significantly promoted the proliferation and angiogenesis of endothelial cell HUVEC and EOMA. In the following study, we will detect the signal molecule between the stromal-endothelial interaction through in vivo and in vitro experiments to reveal the mechanism and signaling pathway. The result of this study will boost the understanding of gene mutations' effect on tumor angiogenesis of breast cancer as well as develop a potential alternative of novel targeting therapies and gene diagnosis techniques.

乳腺癌是严重威胁女性健康和生命安全的恶性肿瘤，但其分子病理机制至今仍不十分清楚。癌组织中不同细胞间的信号通讯对肿瘤的发生发展近期受到人们高度关注。PI3K是细胞内众多信号转导网络中心的重要激酶，研究发现约30%的乳腺癌病人PI3K 基因发生突变，这种突变对乳腺癌的发生发展有何意义很不明确。本项目将围绕肿瘤组织细胞之间相互关系，研究基质成纤维细胞PI3K激酶的p85α亚基突变在乳腺肿瘤血管生成中的作用。前期初步研究结果发现，p85α突变的成纤维细胞条件培养基（CM）可显著促进血管内皮细胞HUVEC增殖及血管环的形成，后续研究将在现有基础上，通过体外和体内实验，确定基质成纤维细胞p85α突变促进血管内皮细胞增殖和转移的信号分子，并阐明其作用机理和信号转导途径。研究结果将为理解基质细胞基因突变对乳腺癌发生发展的意义、发展针对特定靶点的治疗方法和早期基因诊断手段提供可行的实验方法和理论依据。

国家自然科学基金青年科学基金项目(项目编号：81472550)， 项目名称“基质细胞p85突变在乳腺肿瘤血管生成中的作用研究”，总资助金额 72万元，起止日期 从 2015 年 1 月到 2018 年 12 月。目前关于项目的主要研究成果有四方面。.第一个方面，研究TEAD4及其缺失突变体在HeLa细胞中的定位。为了探究TEAD4的入核机制，我们首先从其氨基酸序列着手，通过PSORTⅡ软件预测了TEAD4可能的两段核定位序列，分别为59PPCGRRKI66、105LARRK109，并构建了这两段序列的缺失突变体，我们发现缺失59-66位氨基酸序列导致TEAD4在细胞核内异常聚集；缺失105-109位氨基酸序列则导致TEAD4在胞浆中出现。.第二个方面，通过定点突变研究维持TEAD4蛋白稳态的关键位点。我们进行定点突变实验，分别将三个半胱氨酸残基突变为丝氨酸，结果发现C61S、C335S、C367S的TEAD4蛋白表达水平均低于野生型，尤以C335S、C367S最为明显，应是发生了降解。因此，推测TEAD4 C335、C367是维持其蛋白稳定的关键位点。.第三个方面，通过RNA干扰、定点突变研究TEAD4对细胞增殖、转移、周期的影响。为了研究这两种缺失突变体对细胞生命活动的影响，我们通过慢病毒载体将全长TEAD4以及两种缺失突变体导入HeLa细胞中，结果表明，相较于导入全长TEAD4的HeLa细胞和野生型HeLa细胞，导入了缺失突变体的HeLa细胞的细胞活力、迁移能力明显下降，细胞粘附性增强，细胞周期相关蛋白表达水平下降。.第四个方面，通过RNA干扰研究TEAD4基因沉默对乳腺癌细胞凋亡及周期蛋白表达的影响。使用构建好的慢病毒表达载体（pLKO.1-TEAD4-siRNA）在相同条件下分别感染MDA-MB-231、MCF-7两种细胞，Western-blot检测CDK4、CDK2、cyclinE等周期蛋白的表达量。借助流式细胞仪检测细胞凋亡情况。.在这些工作的基础上，已经发表的由本基金支持的 SCI 文章 6 篇，在投文章 2 篇，将在两年内发表。该基金培养了 9 名研究生，4 名已经毕业，5 名在读。经费严格按照计划规定使用，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。