酿酒酵母木质纤维素全糖乙醇发酵代谢工程基础问题的系统生物学研究

燃料乙醇其独特的"车用"属性而倍受新型能源领域的关注，纤维素乙醇生产已成为研发热点，实现经济盈利的纤维素乙醇生产还有许多科学问题亟待解决，其中之一是纤维素全糖乙醇发酵。木糖在纤维素中的含量仅次于葡萄糖，但传统乙醇工业生产菌酿酒酵母不能转化木糖，拓展酿酒酵母乙醇发酵底物的代谢工程已有大量研究工作，但木糖代谢工程菌木糖/乙醇转化速率(g/g.h)低，不能与葡萄糖共转化速率发酵依然是瓶颈。木糖到乙醇代谢过程复杂，许多基础问题尚认识不足。系统生物学是研究特定生物系统中所有组分变化及相互作用的，关键是对扰动系统的各种组学的规模化分析比较。本项目拟在前期构建的酿酒酵母木糖代谢菌株的基础上，通过多种手段建立合适扰动系统，针对提高木糖/乙醇转化速率基础问题，开展系统生物学研究，揭示木糖代谢整体调节的分子机制，推进酿酒酵母木糖代谢网络模型建设，为提高酿酒酵母木糖代谢工程菌糖醇转化速率的进一步改造提供理论依据

燃料乙醇其独特的"车用"属性而倍受新型能源研究领域的关注，纤维素组分的全糖乙醇发酵以及提高发酵菌株在粗放条件下的生产特性，是实现经济盈利的纤维素乙醇生产亟待解决科学问题之一。传统乙醇工业生产菌酿酒酵母不能转化纤维素中的木糖，拓展酿酒酵母乙醇发酵底物的代谢工程已有大量研究工作，但木糖代谢工程菌木糖转化乙醇的速率低、纤维素预处理过程产生的毒性物质对酿酒酵母生长及乙醇发酵的抑制，依然是第二代燃料乙醇产业化的关键技术瓶颈。.本项目在前期工作的基础上，通过理性引入外源途径、强化内源代谢流向以及非理性的适应性进化等措施，建立了酿酒酵母对木糖利用的遗传扰动（perturbation）体系。通过经典遗传学诱变选育技术结合现代分子生物学技术，建立了酿酒酵母对毒性物质抗性的遗传扰动体系。通过发酵过程的条件调整优化，以及毒性物质在发酵过程中对酿酒酵母生长及代谢物产生的影响，建立了的环境扰动体系。在此基础上，根据系统生物学研究理念，对不同扰动系统进行各种组学的规模化分析，配合遗传及生化分析手段，分析了酿酒酵母木糖代谢整体调节及高抗逆的分子机制。①酿酒酵母高效木糖的乙醇发酵，外源性上游代谢途径的引入及内源性下游代谢途径的强化是基础，木酮糖激酶效率、磷酸戊糖途径等代谢节点，葡萄糖抑制系统的调节、代谢中间产物如2,6-二磷酸果糖对糖酵解代谢酶的直接变构调节、及糖运输蛋白等对提高糖醇转化率起到关键作用；一些非基础转录因子例ASK10也可能对木糖代谢效率起到重要作用。②通过辅酶扰动减少木糖代谢过程中副产物（甘油及木糖醇）的积累，适度表达量的外源NADH氧化酶（noxE），对XI途径，可以减少84%的甘油产生；对XR-XDH途径，可以减少60% 的木糖醇及83%的甘油产生，提高了乙醇积累量。③异源表达对酚类化合物有氧化作用的外漆酶可以提高酿酒酵母的抗性；细胞氧化还原酶水平、抗氧化水平是细胞本底高抗性的基础，过氧化物酶体的功能状态可能与高抗逆性密切相关。④对即是毒性物质又是电子受体的糠醛对酿酒酵母乙醇发酵影响的代谢流分析表明，合适的糠醛添加方式，可以通过氧化还原反应，协调两种辅酶I、II及其氧化态、还原态的周转速率，以减少副产物木糖醇的积累，使代谢通量分布向有利于产生乙醇的方向倾斜。.项目研究按计划进展顺利，部分内容超额完成研究计划，同时得到了适于第二代燃料乙醇生产的酿酒酵母工业菌株，模拟工业条件下的糖