先天性白内障大家系致病基因的定位克隆与功能研究

Congenital cataract is a significant cause of vision loss in infants. One quarter of congenital cataract is hereditary. It is a clinically and genetically heterogeneous lens disorder. This research focused on the pathogenesis of congenital cataract. We collected one so far the largest congenital Coppock cataract family. Gene scan and DNA sequencing were performed to localize and identify the susceptible gene. Direct sequencing of the candidate GJA3 gene revealed a G143R mutation. In order to confirm the pathogenesis of the mutation, first of all, analysis the correlation of gene mutation and congenital cataract, confirm the result of gene scan; Second, since GJA3 is gap-junction protein, based on this point, examine the function of wild type and mutation type in molecular and cellular level, investigate the pathogenic mechanism of GJA3 gene mutation; Finally, through establish the gene mutation rat model, confirm GJA3 gene mutation is the pathogenesis of congenital Coppock cataract. This research aims to through the clinical screening-mechanism research-animal model to verify the pathogenesis of congenital Coppock cataract. The results will provide scientific basis for early diagnosis, prenatal diagnosis and gene therapy of congenital cataract.

先天性白内障是儿童主要致盲眼病之一，主要由于遗传因素所致，有临床和遗传异质性。本课题着眼于先天性白内障的发病机制研究，收集迄今为止人数最大的先天性Coppock白内障大家系，从基因扫描入手筛选先天性白内障的致病基因，对候选致病基因进行突变检测，发现GJA3基因的143位突变是潜在的致病原因。为了进一步确认此突变的致病性，首先，分析突变与疾病发生的相关性，确实前期的基因扫描结果；其次，由于GJA3是细胞连接相关蛋白，以此为切入点，在分子，细胞水平对其野生型和突变型的功能进行考察，明确GJA3基因突变的致病机制；最后，通过建立基因突变鼠模型，确实GJA3基因突变是Coppock白内障致病原因。本研究旨在通过临床筛查- - 机制研究-动物模型核实，全面而可靠地研究先天性Coppock白内障的发病机制。研究结果将为先天性白内障的早期诊断、产前诊断和基因治疗提供科学依据。

先天性白内障是儿童主要致盲眼病之一，主要由于遗传因素所致，有临床和遗传异质性。.本研究首先通过对一个超大先天性Coppock白内障大家系的致病基因的定位与克隆研究，确定了此家系的致病基因突变。精细定位和单体型分析将致病基因定位于微卫星标记D13S1316和D13S1275之间，遗传距离约6.99厘摩（cM），染色体位置为13q12.11。这个区域内有编码缝隙连接蛋白的候选基因GJA3。候选基因直接测序，发现GJA3基因的第1外显子第427碱基一个G->A的点突变，密码子GGG->AGG，导致多肽编码序列的第143位甘氨酸变为精氨酸（G143R，或Gly143Arg）。家系所有白内障患者都具有相同的点突变，而家系中的正常人和100名正常对照未发现这个突变，排除了多态性的可能。确定GJA3基因G143R突变是该家系的致病基因突变。.本研究然后对GJA3基因G143R突变的功能进行了研究。以正常人血基因组DNA为模板，通过PCR野生型目的基因并通过DNA重组技术克隆至真核表达载体pEGFP-N1。突变技术构建携带突变基因的质粒，分别转染至人晶状体上皮细胞(HLEB-3)及宫颈癌上皮细胞(HeLa)。激光共聚焦显微镜下观察蛋白定位。免疫荧光技术检测晶状体上皮细胞中GJA3(Cx46)的表达分布及缝隙连接形成情况。流式细胞分析术检测转染细胞的凋亡情况。Westem-blot法检测凋亡相关蛋白caspase3的表达。分别成功构建表达野生型Cx46蛋白的质粒pEGFPN1-wtCx46及表达突变蛋白的pEGFP-N1-Cx46G143R，转染HeLa及HLEB-3细胞后发现突变蛋白呈团块样聚集，这种蛋白的聚集导致缝隙连接形成失败，并影响了Cx46形成缝隙连接的能力。流式细胞分析证实了细胞凋亡比例增多，Westem-blot发现总caspase3表达降低，而剪切的caspase3增多，提示了细胞凋亡通路的激活。.本研究首次发现GJA3基因一个新的先天性白内障疾病相关点突变G143R。该突变可以导致蛋白的聚集、缝隙连接形成失败，进而引起细胞凋亡。本研究拓展了先天性白内障的基因突变谱，揭示了缝隙连接蛋白突变导致先天性白内障发病的新机制。同时提示Cx46蛋白在维持晶状体正常生理状态中担当重要作用，为先天性白内障的预防和基因治疗提供了理论基础。