SHP-2调控NLRP3炎症小体激活在足细胞焦亡中的作用及机制研究

Podocyte injury has been identified as a pivotal event resulting in proteinuric kidney disease, glomerulosclerosis, and loss of renal function. Podocyte loss is potentially a key factor that contributes to diabetic nephropathy development and progression. Pyroptosis, caspase1-dependent programmed inflammatory cell death, also contributes to the target organ damage in diabetes. Recent studies indicate that NLRP3-inflammasome activation promotes pyroptosis. But, the mechanism of NLRP3-inflammasome activation affects podocyte pyroptosis is still unclear. We have recently found that high glucose decreased SHP-2 (the important regulator of inflammasome-pyroptosis pathway), and podocyte pyroptosis. This project intends to investigate the role and mechanisms of SHP-2 in regulation of podocyte pyroptosis in diabetic nephropathy. Biopsy specimens from DN patients and STZ-induced diabetes model will be used to evaluate the expression and phosphorylation of SHP-2, NLRP3 inflammasome activation and podocyte pyroptosis. In human podocytes with high glucose exposure, we wil analyze the effect of podocyte pyroptosis via altering the activity of NLRP3-inflammasome related molecules by specific inhibitors. We will explore the potential mechanism of SHP-2 in regulation of podocyte inflammasome-pyroptosis pathway via altering the expression and activity of SHP-2 with inhibitor or SHP-2 KO CRISPR/Cas9 plasmids or SHP-2 mutant vectors. This project will provide a new theoretical basis for the effective prevention of podocyte injury.

足细胞损伤、丢失是糖尿病肾病发生、进展的主要原因之一。研究报道细胞焦亡（Pyroptosis）参与糖尿病靶器官损害，NLRP3炎症小体活化是细胞焦亡的重要上游事件，但其激活机制及是否导致足细胞焦亡仍不清楚。我们前期研究发现，高糖可诱导炎症小体-焦亡途径的调节分子SHP-2表达改变和足细胞焦亡。本项目拟探讨SHP-2在糖尿病肾病足细胞焦亡中的作用及机制。通过研究DN患者肾活检标本、构建STZ糖尿病模型评价SHP-2表达与NLRP3炎症小体活化、足细胞焦亡的关系；通过体外培养足细胞、改变炎症小体通路相关蛋白活性，观察对细胞焦亡的影响；应用抑制剂、CRISPR/Cas9敲除质粒及活性突变质粒转染改变SHP-2表达或活性，通过检测下游信号分子进一步明确SHP-2调控炎症小体-焦亡途径的机制。本研究将为有效防治足细胞损伤提供新的理论依据。

足细胞脱落、死亡、足突融合等导致足细胞数目减少和（或）密度减低是蛋白尿形成、糖尿病肾病进展的主要机制。细胞焦亡是一种与炎症相关的程序性细胞死亡形式，与炎症小体异常活化有关。研究报道细胞焦亡（Pyroptosis）与肾脏损伤密切相关，体外研究发现，缺氧及高糖均可诱导的肾小管细胞焦亡。NLRP3炎症小体在多种疾病过程中都发挥了关键作用，还参与识别非微生物危险信号并介导细胞焦亡的发生。糖尿病肾病动物模型及体外高糖刺激的足细胞均出现NLRP3炎症小体活化。SHP-2隶属于非受体酪氨酸磷酸酶家族，由PTPN11基因编码。已知SHP-2参与调控炎症反应、细胞存活、代谢平衡等过程，其稳定性对细胞正常功能非常重要。研究发现，SHP-2可通过多种途径调控NLRP3-炎症信号活化。本项目研究内容包括：1.通过构建链脲佐菌素（STZ）糖尿病模型，观察肾脏足细胞SHP-2表达改变及炎症小体-焦亡相关蛋白表达，评价足细胞形态学改变与蛋白尿的关系；2.应用SHP-2抑制剂，进一步评价SHP-2在肾脏足细胞焦亡及蛋白尿中的作用；3. 通过干扰RNA技术人为调控SHP-2在足细胞中的表达，进一步评价SHP-2对NLRP3炎症小体活化和足细胞焦亡的影响。研究结果发现，SHP-2沿肾小球毛细血管袢呈细线样分布，链脲佐菌素（STZ）糖尿病模型肾小球SHP-2表达上调，伴NLRP-3，caspase-1表达增加；电镜下观察糖尿病肾病肾组织足细胞肿胀，细胞核固缩，胞浆内容物崩解，可见胞膜破裂，提示细胞焦亡发生；应用SHP-2抑制剂可减轻STZ诱导的糖尿病模型足细胞足突融合、肾小球硬化及蛋白尿的发生，拮抗NLRP3-caspase-1细胞焦亡的发生；体外培养足细胞，高糖可诱导SHP-2表达上调，且具有时间依赖性和浓度依赖性，伴足细胞NLRP-3，caspase-1表达增加；干扰RNA技术人为调控SHP-2在足细胞中的表达，可拮抗高糖诱导的NLRP-3，caspase-1高表达，并减轻足细胞骨架重排和足细胞焦亡。本项目研究结果证实高糖通过诱导足细胞NLRP3炎症小体活化导致足细胞焦亡，SHP-2参与调控NLRP3-caspase-1-细胞焦亡信号通路，进而调控足细胞生物学功能；本研究进一步揭示糖尿病肾病足细胞损伤的分子机制，为糖尿病肾病防治提供新思路的目标。