登革病毒四价疫苗免疫新策略的研究

Dengue fever is the most widespread human viral hemorrhagic fever caused by dengue virus (DENV,DV) infection and no successful vaccine is currently available. There are four antigenically related but distinct serotypes，so a tetravalent DV vaccine candidate must be more ideal. In our previous research, the structural protein prM-E of DV has been proved to induce powerfully effective protection with its high immunogenicity. Consequently, the prM-E protein will be used as a target for the DV vaccine candidate in this study. To enhance the antigen-presenting effect, we will use the novel, safe and biodegradable nanoparticle system to prepare the DNA vaccine; additionally, the heterologous prime-boost (DNA prime-Protein boost) technique will be used in order to enhance the immune responses elicted by vaccines. Firstly, eukaryotic expressing plasmids encoding the prM-E gene of DV1-4 will be constructed and prepared to form poly lactic-co-glycolic acids (PLGA) nanoparticles; then animals will be prime-immunized with these sustained-release DNA-nanoparticles. Secondly, the E protein of DV serotypes 1-4 expressed by the baculovirus-insect cell expression system will be used for the boost-immunization. And then, the humoral and cellular immune responses as well as the challenge test will be examined to evaluate the immunogenicity, protection of the vaccine candidate and the result of the heterologous prime-boost strategy. We will try to employ this approach to address DV vaccine development objective and provide further insight into other virus vaccines especially flaviviruses.

登革热是由登革病毒（DENV,DV）引起的流行最为广泛的人类病毒性出血热，目前尚无安全有效的疫苗用于预防。DV有四个抗原性相关而又不同的血清型，因而四价的DV疫苗更为理想。以往我们的工作已证明DV的结构蛋白prM-E具有良好的免疫原性和免疫保护作用，因此本课题选择四型DV的prM-E蛋白为靶抗原，拟利用纳米技术进行DNA疫苗制备以提高抗原呈递效果，并采用（DNA+蛋白）异源疫苗prime-boost的策略进行免疫，以弥补DNA疫苗的不足，更全面诱导有效的免疫应答反应。首先构建四型DV的prM-E真核表达质粒，制备形成缓释聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒，进行初次免疫；继而利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统分别表达相应的病毒蛋白，进行加强免疫；通过检测体液免疫和细胞免疫指标及攻毒实验结果，评估疫苗的免疫原性和免疫保护作用以及该免疫策略的效果，为特异性预防DV以及其它黄病毒感染提供新思路。

登革病毒（Dengue virus，DV）为重要的蚊媒病毒，每年造成约3.9亿人感染。近年，世界范围内的登革热疫情频繁暴发，特异性预防极为重要。DV有四个抗原性相关的血清型，因而四价DV疫苗更为理想。由Sanofi Pasteur生产的CYD-TDV疫苗，虽然2016年在少数国家获批上市，由于存在对DV2免疫效果较弱以及感染增强的风险，目前已被禁止使用。为此，研发更安全有效的DV四价疫苗，仍是亟待解决的问题。. 本课题选择具有制备简单、安全、经济等优点的核酸疫苗，以DV四种血清型的prM-E基因为靶分子，利用FDA认证的可用于人体DNA疫苗研究的pVAX1为表达载体，分别构建了DV1-4的单价DNA疫苗。为增进免疫效果，采用在体电脉冲肌注法（electroporation, EP）免疫动物，通过与传统肌肉注射方式进行比较，分别评价了DV1-4单价DNA疫苗、DV1、2双价DNA疫苗的免疫原性和动物保护作用。结果证明，50μg 单价DNA疫苗经EP方式同源免疫可诱导小鼠产生高水平特异性体液和细胞免疫应答，并提供有效的免疫保护；双价DNA疫苗可诱生较高水平且均衡的DV1、2特异性体液免疫应答，且能较好地抵抗DV1、2的攻击。在此基础上进一步评价了四价DNA疫苗的免疫原性和保护作用，结果说明，经EP免疫了四价疫苗的小鼠，对DV1-4均能产生较高的特异性抗体水平，体液免疫应答较均衡，能有效地同时抵抗DV1-4的攻击，且攻毒后未观察到明显的病情加重的ADE效应。此外，较大动物实验结果显示，500µg DV2型DNA疫苗经EP免疫可诱导白兔产生较强的体液免疫应答。. 本课题还利用DV四种血清型共有序列构建四价疫苗cE80，并利用优化的DNA-prime和蛋白boost的异源免疫策略进行接种，发现疫苗可诱导DV1-4特异性抗体，并提供免疫保护作用，但存在四种血清型间抗体水平差异大、保护效果不均衡的现象，以抗DV2抗体效价及保护性免疫效应最强，此结果和cE80序列与DV1-4的E80序列间的同源性差异相符。因此，利用DV1-4共有序列cE80进行四价疫苗的研发，不能达到理想效果，应另辟蹊径。. 综上所述，本课题为登革四价DNA疫苗在大动物中的进一步研究奠定了重要基础。同时为特异性预防DV以及其它黄病毒感染提供了新思路。