双铁加氧酶CmlA含氧活性中间体结构预测及其C(sp3)-H键活化机理探索

Diiron oxygenases are a common class of iron-containing oxygenases. Their structures of oxy species, are crucial both to decipher the O2 activation mechanism therein, and to form a basis for clarifying their substrate oxygenation mechanisms. However, the structures of oxy species for many diiron oxygenases are unavailable from experimental study. Concerning this conumdrum, this project plans to adopt a combined approach based on multi-scale QM/MM modeling and Fe-57 Mössbauer spectroscopic modeling, to first predict the structures of oxy species, then explore the substrate C(sp3)-H bond activation mechanism. The diiron oxygenase under investigation in this project is the amino acid β-hydroxylase CmlA in biosynthesis of antibiotic chloramphenicol. We will intensely explore the chemical and structural form of oxy species, the unsymmetric issue of the iron subsites, the connection between the Mössbauer spectroscopic parameters and the structures, as well as the corresponding novel C(sp3)-H bond activation mechanism. The novel O2 activation mechanisms of diiron oxygenases, can deepen our understanding for the structure-function relationship of multinuclear metalloenzymes. In addition, the combined computational approach and strategy based on QM/MM multi-scale modeling and Mössbauer spectroscopic modeling, would enrich the tools of theoretical modeling for metalloenzymes, and increasing the predicting ability of QM/MM multi-scale modeling.

双铁加氧酶是自然界中普遍存在的一大类含铁氧化酶，其含氧活性物种的结构，是揭示其氧分子活化机制的关键，也为其底物氧化机理的阐明提供了基础。然而，很多双铁加氧酶含氧活性物种的结构，目前都无法通过实验方法得到。本项目针对这一难题，拟采用多尺度QM/MM结合Fe-57核穆斯堡尔谱模拟的方法，首先通过理论计算预测双铁加氧酶含氧活性物种结构，在此基础上探索其底物C(sp3)-H键活化的新机理。本项目的研究对象为氯霉素生物合成中的氨基酸β-羟化酶CmlA，将重点探讨含氧物种的形式和结构、双铁活性中心的不对称性、结构和穆斯堡尔谱参数的关系、以及C(sp3)-H键活化新机理。这些氧分子活化新机制的揭示，可增进我们对自然界中多核金属酶结构-功能关系的理解。此外，本项目探索的多尺度QM/MM方法结合穆斯堡尔谱模拟的计算策略，将丰富金属酶体系理论计算模拟的研究手段，提高QM/MM多尺度模拟方法的预测能力。

双铁羟化酶CmlA，在氯霉素生物合成第一步转化中，催化了对氨基苯丙氨酸β位C(sp3)-H键的羟基化反应。在本项目研究工作中，我们主要通过多尺度模拟方法，对CmlA含氧活性中间体的结构、氧分子活化机制、以及C(sp3)-H键羟基化机理，开展了理论计算研究。研究发现，CmlA底物对氨基苯丙氨酸中待羟化的β位C(sp3)-H键邻位上自带的氨基，通过N-O成键，可以协助氧分子活化中O-O键发生异裂，从而产生了双三价Fe-O-Fe中间体作为CmlA中真正的C(sp3)-H羟基化活性中间体。该种氨基辅助的双铁活性中心氧分子活化新机制，既不同于传统可溶性甲烷单加氧酶sMMO，也不同于甲苯单加氧酶T4MO。此外，研究还发现，氧分子活化过程中形成的N-O键，在碳氢键羟化完成后，会逆向发生断裂，从而使底物中的氨基得以再生，最终实现了氨基无痕协助氧分子活化的效果。最后，研究中发现的双铁第一配位层桥式羟基在氧分子配位后的重组现象，也为今后研究相关双铁加氧酶氧分子活化过程中发现新结构与新机制，提供了可能性。