从记忆Ｂ细胞制备广谱中和抗流感病毒人源单克隆抗体及抗病毒作用研究

Influenza pandemic is a persistent threat to public health. Influenza vaccine is the primary strategy for prevention and control of influenza. However, the current influenza vaccine is suboptimal due to high variation of influenza viruses. Neutralizing antibodies can protect the body from viruses. The passive immunization and treatment of specific antibodies have many advantages, such as rapid and good effect. Therefore, broad-spectrum neutralizing monoclonal antibodies (mAbs) against influenza viruses may be more potential for effective prevention and treatment of influenza. In previous studies,we have established the new method of generating fully human mAbs from human peripheral blood lymphocytes (hu-PBL) at a single cell level. And using in vitro induction, we obtained plasma cells from activated memory B cells in hu-PBL for generating mAbs. In this study, using our estabished methods, we will produce fully human mAbs against influenza viruses from peripheral blood with neutralizing influenza viruses from patients or recovery volunteers who infected with influenza. Further, we will screen broadly cross-reactive and high affinity human mAbs against influenza virus strains and subtypes by analysis of their features, including mAbs against highly conserved antigenic sites of influenza viruses; and detect the neutralizing activity of potential mAbs against influzenza viruses. Human mAbs induced by memory B cells may be broadly cross-reactive against multiple influenza strains, so we can obtain human mAbs with broadly neutralizing activity from memory B cells. The study makes basis for the research of preventive vaccine and therapeutic antibody drugs for influenza.

流感暴发流行严重威胁人类健康。流感疫苗是主要预防和控制流感流行的措施之一。流感病毒易发生变异，使疫苗在流行时期难以有效应用。中和抗体具有抵抗病毒保护机体的作用。特异性抗体的被动免疫和治疗具有见效快、作用效果好等特点，因此广谱中和性抗流感病毒单克隆抗体（单抗）可能对高效预防和治疗流感更具有潜力。前期研究中我们建立了制备全人源单抗新技术。本研究拟采用流感患者或恢复期志愿者中具有中和流感病毒能力的外周血，通过体外活化记忆B细胞分化浆细胞，进而从单一浆细胞中制备人源抗流感病毒单抗。通过抗体功能特性分析筛选具有高亲和力和广谱中和性的抗流感病毒株或亚型的单抗，包括流感病毒高度保守抗原位点的特异性单抗；对有潜力的单抗进行抗流感病毒作用的研究。记忆B细胞产生的人源抗流感病毒单抗可能同时对多种流感病毒株有抵御作用，因此可获得广谱中和性的抗流感病毒单抗，为预防性流感疫苗和治疗性抗体药物的研究奠定基础。

流感是临床常见的急性呼吸道传染病，它可导致严重的并发症，甚至死亡。流感暴发流行严重威胁人类健康。流感疫苗是主要预防和控制流感流行的措施之一。流感病毒易发生变异，使疫苗在流行时期难以有效应用。中和抗体具有抵抗病毒保护机体的作用。特异性抗体的被动免疫和治疗具有见效快、作用效果好等特点，因此广谱中和性抗流感病毒单克隆抗体（单抗）可能对高效预防和治疗流感更具有潜力。本研究利用全人源单抗新技术，通过建立体外活化记忆B细胞分化浆细胞，进而从中制备人源抗流感病毒单抗，并对抗流感病毒单抗的作用机制进行分析。. 通过从接种过流感疫苗志愿者外周血建立体外活化方法促进B细胞扩增和分化浆细胞。分别加入TLR9激动剂CpG DNA 2006和细胞因子等培养；流式细胞分析、ELISA、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）、细胞计数法等多种方法评价B淋巴细胞体外活化效果，最终确立了确定的体外活化方法是CpG DNA 2006（10 µg/ml），IL-2（100 ng/ml），IL-4（20 ng/ml），抗CD40抗体（2 µg/ml）为良好的非特异性诱导初始B细胞及记忆B细胞体外增殖、活化和分化浆细胞的条件。通过建立的最佳体外活化方法，增强记忆B细胞的增殖活化以及分化为浆细胞，分离抗体恒定区基因；经克隆，筛选，以及基因测序等过程，确定成功构建含恒定区基因载体，利用使用蛋白表达体系进行纯化，建立记忆B细胞体外活化、扩增以及抗病毒流感单克隆抗体制备技术。利用制备的抗流感病毒A基质蛋白2胞外区特异性抗体M2eAb进行抗病毒作用和机制的研究。在体外实验中，M2e Ab可分别对H1N1和H3N2感染的人支气管内皮细胞发挥抑制作用，随时间和剂量的增加而增强。在体内鸡胚感染病毒实验中，M2eAb对感染H5 Re-7 、H9病毒株具有中和作用。在免疫调节机制研究中证实M2e Ab可能通过影响IL-8和MCP-1等炎性细胞因子的表达，并不同程度抑制NF-κB表达，进而发挥抗病毒作用。. 综上所述，本研究确定了记忆B细胞体外活化方法，并掌握了抗病毒流感单克隆抗体制备技术，并证实M2eAb可通过影响免疫因子的表达，并抑制相关信号通路，从而在体内、外抗流感病毒感染中发挥作用。本研究对流感病毒感染机制的解析以及流感病毒防治策略选择具有重要的理论和实际意义。..