微小隐孢子虫类钙调蛋白在激活Ca2+转运通道中的作用机制

Cryptosporidiosis is one of foodborne parasitic zoonosis causing serious harm, and so far there is still no effective drug and therapy for treatment. Ca2+ as a second messenger, has been shown to be important for the vital processes in Cryptosporidium Spp.(such as the secretion of adhesion factors, gliding motility, in and out of the host cell and immune evasion). Calmodulin-like proteins (CMLs) as an important receptor are involved in Ca2+ signaling transduction, and play important role in the life activities of Cryptosporidium. Our previous researches showed that Calmodulin-like protein (CpCML) presents in Cryptosporidium parvum (C.parvum). As an important receptor like Calmodulin proteins (CaMs), CpCML can be involved in Ca2+ transport, but the specific mechanism is still unknown..Therefore, homologous protein modeling for CpCML will be used for predicting the site of Ca2+-binding. And then, the binding ability of Ca2+ will be researched by construction of CpCML mutant and Ca2+ in-out-in test. Interacting proteins of CpCML will be screened using the estabilished yeast two hybrid library of C.parvum at first. Then, the final target protein——plasma membrane type Ca2+-ATPases.(P-type Ca2+-ATPases，PMCA) and ryanodine receptors（RyRs）will be determined by detecting CMLs-binding domain (Baa motifs and IQ motifs), and the results can be verified by Co-immunoprecipitation(Co-IP) and subcellular localization. The above can illuminate the mechanism of CpCML for activating Ca2+-transport channels. At the same time, in vitro invasion assay will be used to evaluate the effect of CpCML on C.parvum pathogenicity, to provide the theoretical basis for candidate vaccines and drug targets.

隐孢子虫病是一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病，迄今为止尚无有效的预防和治疗药物。Ca2+作为第二信使，调控隐孢子虫的大量生命活动。申请者前期研究发现，微小隐孢子虫(C.parvum)体内具有类钙调蛋白(CpCML)，其作为Ca2+的重要受体蛋白，与钙调蛋白一样参与Ca2+的转运，但具体机制尚不清楚。因此，本研究利用蛋白质同源建模预测CpCML的Ca2+结合位点，通过构建CpCML突变体，研究其与Ca2+结合能力的变化进行鉴定；利用C.parvum酵母双杂交文库和典型CMLs结合结构域序列筛选与膜上转运相关的互作蛋白——细胞膜钙转运ATP酶(PMCA)和兰尼碱受体(RyRs)，利用Co-IP和亚细胞定位进行验证；初步阐明CpCML在激活C.parvum Ca2+转运通道中的作用机制。同时，利用体外入侵试验观察CpCML对C.parvum致病性的影响，为其作为候选疫苗和药物靶标提供依据。

本项目通过开展CpCML与钙离子的结合情况以及通过在微小隐孢子虫中的互作蛋白预测其发挥的作用，为隐孢子虫的防治提供新思路。本项目发表研究论文9篇（其中SCI论文2篇），培养硕士研究生2名，获得国家标准1项，参编著作1项。完成了项目申请书的研究内容和考核指标，相关研究成果如下：.1）得到CpCML的互作蛋白——核仁纤维蛋白RNA甲基化酶.本研究结果表明，在微小隐孢子虫中，CpCML与核仁纤维蛋白RNA甲基化酶有互作关系，两者共同定位于微小隐孢子虫子孢子膜上。.介于核仁纤维蛋白RNA甲基化酶的作用对象——宿主细胞核仁纤维蛋白是帮助病毒运动和抑制宿主细胞干扰素途径的关键蛋白，本研究的发现为进一步研究微小隐孢子虫的入侵和寄生机制提供新的参考。.2）CpCML和CpCML截短突变体钙离子结合能力比较.本研究结果显示，CpCML可以结合Ca2+，并呈剂量依赖性，但当超过阈值后会出现抑制现象；而对于CpCML钙离子结合位点缺失突变体，缺失的钙离子结合位点越多，对Ca2+的结合能里越弱，直至消失。本研究揭示CpCML的钙离子结合特性，为进一步研究微小隐孢子虫钙离子结合蛋白发挥相关功能的条件奠定基础。.3）CpCML对微小隐孢子虫致病力的影响.由于CpCML定位于微小隐孢子虫子孢子表膜，推测其可能与虫体的入侵致病相关，于是应用抗体阻断试验对CpCML对微小隐孢子虫入侵率进行比较，结果表明，CpCML抗体对微小隐孢子虫入侵率几乎没有影响，提示其不直接作用于虫体入侵阶段，可能依靠结合互作蛋白在抑制宿主细胞清除虫体寄生方面发挥作用，为进一步研究微小隐孢子虫逃避宿主细胞清除机制提供新的研究方向和思路。.综上所述，CpCML为Ca2+剂量依赖型蛋白，对微小隐孢子虫入侵不产生直接影响，但可能与抑制宿主细胞清除虫体寄生机制相关，为后续对微小隐孢子虫在宿主细胞内持续感染的作用机制研究提供新的研究思路。