肺腺癌细胞中Connexin31.1的间隙连接非依赖性功能及其相互作用蛋白

Cx可通过形成细胞间的间隙连接（GJIC）起作用，近年来Cx的GJIC非依赖性功能受到重视。前期研究中发现Cx31.1能抑制肺腺癌细胞的转移，并阻滞细胞周期在G1期。细胞免疫荧光和细胞膜生物素标记实验表明，Cx31.1定位在内膜系统，而不定位在细胞膜上，表明Cx31.1对肺腺癌细胞转移和增殖能力的控制并不是通过形成GJIC实现的。本研究拟通过稳定表达Cx31.1的细胞系的全基因表达谱，利用基因共表达等分析方法预测与Cx31.1直接相互作用的蛋白，通过与Cx31.1的酵母双杂交数据的关联分析挑选要验证的蛋白，尽量减少酵母双杂交系统的假阳性，提高后期验证的效率和准确性。候选的与细胞增殖和细胞转移相关的蛋白经GST pulldown实验体外筛选后，再在细胞内用荧光共定位和免疫共沉淀的方法验证相互作用蛋白，揭示Cx31.1的作用机理及相关信号通路，并发现肺腺癌抗转移和增殖的潜在新的干预点。

通过免疫共沉淀结合质谱分析的方法，经胶内消化以及HPLC-MS/MS检测后，我们得到了跟Cx31.1相互作用的一些候选蛋白。这些蛋白包括热休克蛋白，跟生殖相关的蛋白以及跟降解相关的蛋白。跟蛋白降解相关的一些蛋白质中，包含如泛素-蛋白酶体途径中的组分以及自噬降解中的组分。Cx家族蛋白是一类半衰期很短的蛋白，这在膜蛋白中显得很突出。我们之前的研究表明Cx31.1在肺癌细胞系中表达量下降，其可以作为肿瘤抑制因子起作用。Cx31.1的表达量为什么会随着肺癌细胞恶性程度的增加而下降，目前还不得而知。为了研究该蛋白的降解途径，我们在稳定表达Cx31.1的H1299细胞中进行了研究。我们的研究表明，Cx31.1可以通过蛋白酶体途径和自噬途径进行降解。Cx31.1不仅与蛋白酶体的标志蛋白PSMA2共定位，并且在MG132处理后，Cx31.1的表达量上升；饥饿诱导的自噬或是BFA诱导自噬的情况下，Cx31.1的表达量下降，而自噬的抑制剂3-MA和CLQ可以使Cx31.1的表达量上升。免疫荧光的实验表明，在正常情况下和饥饿情况下，Cx31.1-EGFP可以与自噬的标志蛋白LC3共定位。用胶体金标记Cx31.1-EGFP，电镜检测后发现这些胶体金颗粒包含在自噬体状的双层膜内，提示Cx31.1-EGFP可以被自噬体降解。clathrin是在免疫共沉淀中多次被发现的跟Cx31.1-EGFP相互作用的蛋白，经clathrin抗体免疫共沉淀后再次验证了两者的相互作用。免疫荧光实验也证实Cx31.1-EGFP与clathrin可以共定位。最近有研究表明，clathrin可以介导自噬过程。我们用siRNA沉默clathrin的表达，发现Cx31.1-EGFP的表达水平上升，并且Cx31.1-EGFP的上升在饥饿诱导的自噬的情况下比正常培养条件下还要突出，提示clathrin可能介导Cx31.1-EGFP的自噬。总之，我们发现Cx31.1可以被自噬降解，且clathrin在其自噬过程中起作用。