微小隐孢子虫子孢子黏附相关蛋白及其受体识别机制的研究

微小隐孢子虫是一种引起腹泻的重要人兽共患原虫,目前对免疫缺陷患者的隐孢子虫感染尚无有效防制药物。隐孢子虫子孢子与宿主上皮细胞的黏附作用是其侵入和致病作用的关键，但对涉及这一过程中的分子机制尚不清楚。近年来的研究表明，Mucin-like蛋白在寄生原虫与宿主细胞的识别过程中扮演重要角色。本研究在前期筛选获得的两个Mucin-like分子基因序列的基础上，拟首先对序列进行生物信息学分析，然后克隆、表达其膜外区片段，再通过体外阻断实验、ELISA、免疫荧光和Western-blot对结合Caco-2细胞的重组蛋白进行鉴定，从而确定与隐孢子虫侵入相关的配体；以此为诱饵蛋白，通过GST pulldown 从Caco-2膜蛋白中筛选与之结合的受体蛋白，通过质谱测序并与膜蛋白质数据库进行比对，从而获得相应的受体蛋白分子。本研究为从分子水平阐明隐孢子虫子孢子对宿主细胞黏附和侵入的相关机制提供依据。

微小隐孢子虫是世界范围内引起腹泻的重要病原，隐孢子虫子孢子对宿主肠上皮细胞的黏附和侵入是隐孢子虫致病作用的关键，但介导虫体与宿主相互作用的特异性分子及与致病相关的分子机制尚不清楚。本研究首先通过体外培养HCT-8和MDBK细胞，建立隐孢子虫的体外感染模型。通过不同识别特性的凝集素分别与HCT-8和MDBK细胞共孵育，然后加入子孢子，感染后通过Real-Time RT-PCR方法比较不同凝集素处理细胞对虫体侵入和黏附的影响。第二步，通过将不同种类的凝集素与子孢子共孵育，再感染宿主细胞，同样通过Real-Time RT-PCR方法比较不同凝集素与子孢子共孵育对其入侵宿主细胞的影响。第三步，通过用不同浓度的糖分子或糖蛋白与子孢子共孵育，然后感染宿主细胞，再通过Real-Time RT-PCR方法比较不同糖分子与子孢子共孵育对其入侵宿主细胞的影响。最后，用不同种类的酶（O-糖基化酶、N-糖基化酶、唾液酸酶和β半乳糖苷酶）处理宿主细胞，然后加入子孢子，观察对子孢子侵入的影响。实验结果表明，识别Gal/GalNAc糖分子的凝集素和Gal/GalNAc糖分子能够明显阻断子孢子对宿主细胞的侵入；用识别Gal/GalNAc糖分子的凝集素和O-糖基化酶分别处理宿主细胞，能够明显阻断是子孢子侵入宿主上皮细胞。以上结果一致表明，Gal/GalNAc糖分子是微小隐孢子虫子孢子识别宿主细胞表面的特异性受体分子。以往报道评价药物对隐孢子虫黏附和侵入宿主细胞的的影响主要是通过免疫荧光法（计算视野中被标记的虫体数）、ELISA和定量PCR等，这些方法存在局限性.本研究通过Real-Time RT-PCR方法，定量更准确、客观。此外，本研究还对隐孢子虫所特有的含TSP1蛋白质家族的部分蛋白质功能进行了研究，通过对CpTSP6、CpTSP7、CpTSP 8、CpTSP10四种蛋白质的基因的克隆和原核表达，通过Western blotting、亲和ELISA、Cell blot 3种方法检测以上4种重组蛋白对肠上皮细胞是否具有粘附作用。结果表明TSP家族中的CpTSP6和CpTSP8蛋白能够与宿主细胞结合，表明它们参与了微小隐孢子虫与宿主细胞的黏附过程。综上所述，微小隐孢子虫对宿主上皮细胞的侵入是通过识别细胞表面的Gal/GalNAc糖分子，子孢子表面的多种蛋白质(糖蛋白)共同参与了这一过程。