基于重组近红外荧光蛋白的生物传感与活体成像研究

In vivo imaging can provide various valuable information for diagnosis, biomedical and fundamental research. However, it is still designable for molecular probes which can be effectively and safely used for in vivo imaging. This project intends to develop a novel assaying strategy based on a near-infrared fluorescent protein (NIR-FP). A novel NIR-FP-based sensing principle will be proposes, and several recombinant NIR-FP probes and near-infrared bimolecular fluorescence complementation (NIR-BiFC） probes will be constructed for multiple-targets real time in situ detection and imaging, especially for cancer-related enzymes detection at different levels, including in vivo, cellular and in vitro levels. Taking advantages of the superiority of NIR fluorescent probes for deep-tissue and whole-body imaging of small mammals, and that NIR- FP can be encoded and expressed by mammalian cells and the chromophore is ubiquitous in mammalian tissues, and based on the understanding of the relationship between NIR-FP’s structure and function, this project intends to establish a sensitive sensing and imaging platform for multiple-targets detection at multiple levels, and further for antitumor-drug screening.

活体成像技术能为疾病诊断、生物医学和生物基础理论研究提供非常有价值的信息，但目前仍十分缺乏高效安全的哺乳动物活体成像探针。本项目拟发展基于近红外荧光蛋白（near-infrared fluorescent protein, NIR-FP）的传感新策略: 构建多种重组NIR-FP探针和近红外双分子荧光互补（near-infrared bimolecular fluorescence complementation，NIR-BiFC）探针，开发多目标、尤其是肿瘤等疾病相关关键酶的高灵敏体外、活细胞和活体实时原位检测、成像新方法、新技术。本课题利用近红外荧光在活体成像中的优势和哺乳动物细胞自身可编码、合成NIR-FP及其生色团的特点，在充分解析NIR-FP结构/功能的基础上，提出基于NIR-FP的传感新原理，以期建立多对象、多层次、高灵敏的NIR-FP传感、成像新平台和抗肿瘤药物的筛选新平台。

针对目前哺乳动物活体成像中高生物相容性探针匮乏的问题，结合近红外荧光在活体成像中的优势，本项目以近红外荧光蛋白（NIR-FP）为核心开展分子设计，利用蛋白质工程构建多种NIR-FP探针，发展多种基于NIR-FP的传感新原理。主要开展以下五个方面的研究：1. NIR-FP的克隆、表达、纯化及性质研究。成功得到了2种高纯度的近红外荧光蛋白（mIFP和iRFP），并研究了他们的理化性质。2.基于NIR-FP发展生物传感新方法。通过整合近红外荧光和纳米材料的优势，分别构建了基于iRFP和基于近红外量子点的近红外荧光纳米探针，均能用于临床全血样品中葡萄糖的直接检出，为NIR-FPs应用于生物医学分析和临床诊断提供了新策略；3.发展基于NIR-FP的活细胞、活体成像新方法。利用近红外荧光蛋白和富含组氨酸的绿色荧光蛋白，分别建立了pH响应以及荧光/磁共振双模态传感平台，实现了蛋白货物在活细胞和活体水平的精准递送和实时原位监测。4.基于蛋白质工程改造荧光蛋白、扩展其在生物传感领域的应用。利用蛋白表面重构和结构拆合技术设计合成多种荧光蛋白，建立多种基于此的传感成像新方法，为近红外荧光蛋白的改造提供理论支持,并对相关工作进行综述；5.其他能够为NIR-FP应用提供技术支持的工作，包括核酸传感以及主要以肿瘤相关关键酶为对象的蛋白酶活性检测等方面的工作。以上工作将为发展多种目标的高灵敏体外、活细胞和活体分析检测新方法、新技术，为抗肿瘤药物的活体筛选方法的建立开辟新的道路。本项目在相关领域发表SCI收录论文19篇（其中影响因子10.0以上论文3篇，影响因子5.0以上论文14篇），培养了博士研究生6名，硕士研究生8名。完成课题预期目标。