酮病奶牛肝脏氧化应激及其对肝细胞凋亡的影响研究

奶牛酮病是围产期奶牛的一种重要的营养代谢病，其主要的病理学特征是低血糖、高酮血症和高游离脂肪酸血症。本项目以酮病病理状态下的高酮血症和高游离脂肪酸血症削弱肝脏的抗氧化的能力和促进肝细胞凋亡，进而引发肝脏"二次打击"为理论假设。运用分子生物学、细胞生物学和生物化学检测方法，通过在体（酮病病牛）和体外（原代肝细胞）试验，检测肝脏抗氧化指标（超氧化物岐化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛等）作为氧化应激的证据，检测肝脏细胞凋亡及相关基因（P53、解偶联蛋白2、bcl-2、bax和caspase 3等）的表达作为"二次打击"的依据，明确二者的相关性和细胞凋亡的信号通路，及解耦联蛋白2对肝脏的氧化应激和细胞凋亡的调控作用。为确认酮病奶牛存在由高酮血症和高游离脂肪酸血症引起的肝脏氧化应激及其所造成的肝脏损伤，及进一步揭示奶牛酮病的发病机制和寻找新的药物治疗靶点提供理论依据。

酮病是产后初期的奶牛易患的一种重要的营养代谢病, 发病奶牛体内存在高浓度的BHBA，由此可能会导致一系列的氧化应激反应进而促进肝细胞凋亡，引发奶牛严重的肝损伤。在明确酮病的发病机制的基础上，建立有效的奶牛酮病治疗方法可以降低奶牛的淘汰率，提高其生产性能，进而减少由该病所导致的巨大经济损失，对奶牛养殖业的健康发展具有非常重要的现实意义。. 本研究运用酮病奶牛体内试验和BHBA诱导原代培养的犊牛肝细胞凋亡的模型，探索酮病奶牛氧化应激诱导肝细胞凋亡的机制。结果显示，相对于健康奶牛，酮病奶牛处于氧化应激状态，肝细胞凋亡水平加剧。BHBA以剂量依赖性方式诱导肝细胞氧化应激以及NF-κB相关促凋亡mRNA和蛋白表达上调（如：Bax、IκBα、p53），抑制凋亡蛋白的mRNA表达丰度和蛋白表达下调或者无变化（如：mot-2、Bcl-2），当Bcl-2表达增强时，Bcl-2可以和Bax竞争性结合形成Bax/Bcl-2异构二聚体从而对细胞凋亡起到抑制作用，当Bax表达增强时，形成Bax-Bax同二聚体，加速细胞凋亡。. 我们的研究结果也间接说明了Bax mRNA高表达会促进肝细胞凋亡；超微病理学结果也显示BHBA诱导肝细胞核表现出明显的凋亡形态；同时，检测线粒体的UCP2和细胞内钙离子浓度也说明线粒体损伤在BHBA诱导酮病奶牛肝细胞凋亡中起到关键性作用。. 基于本项目的研究结果，我们初步的阐明了酮病奶牛氧化应激和细胞凋亡的机制，高酮体可诱发奶牛的肝脏氧化应激，过多的自由基“二次打击”肝脏，肝细胞凋亡加剧，进而损害肝脏功能。据此，绘制了酮病奶牛肝细胞凋亡机制图。 . 本项目取得的研究成果进一步揭示了奶牛酮病的发病机制，可为奶牛酮病的防治提供重要的理论依据和实践基础。