奶牛酮病乳汁免疫机能及机理研究

There were negative correlation between negative energy balance (NEB) of dairy cows, characters with high blood ketone and high NEFA, with immune function which had been confirmed. That is NEB reduce immunosuppression because the factors of NEB, such as glucose, NEFA, BHBA and glutamine etc., influence the pathway of innate immunity and acquired immune. At the same time, it have been identified that there are a lots of molecular associated with immune function. But, under the conditions of NEB, how is it the composition and quantitative characteristics of molecular associated with immune function in dairy cows milk? Is it enhanced or decreased of immune function in milk? And are there some molecular associated immune which are closely related with condition of NEB? All of them are not clearly. However, this project studies the immune function proteomics of milk of ketotic cows, using the technologies of iTRAQ-MS and SELDI-TOF-MS. We want to confirm the immune proteins profile and potential pre-detective proteins associated with ketosis. We also want to discuss what and how did the milk changed? This project will valuable to clarify the relation ketosis and immune and prove new diagnosis method in milk.

研究证明，奶牛能量代谢负平衡状态与机体免疫机能呈密切的负相关关系，能量负平衡引发免疫抑制，主要是通过能量负平衡指征性指标葡萄糖（Glu），非酯化脂肪酸（NEFA），β-羟丁酸（BHBA）和谷氨酰胺（Gln）等作用于先天性免疫和获得性免疫途径实现的。同时，已经证实奶牛乳汁中存在大量的免疫相关分子。但在奶牛能量负平衡状态下，乳汁中免疫相关分子的组成及数量特征是怎样的？乳汁免疫功能是增强还是减弱？是否存在一些免疫因子与能量代谢负平衡状态密切相关？这些问题还不清楚。因此，本项目运用同位素相对标记与绝对定量质谱 (iTRAQMS)技术和表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术，开展酮病奶牛乳汁免疫功能组学研究，揭示酮病时奶牛乳汁的免疫功能图谱、及产生机理，探寻与奶牛酮病密切相关的潜在乳汁早期预警标示物。为阐明奶牛酮病乳汁免疫特征及酮病早期预警技术奠定理论基础和实践依据。

酮病是围产期奶牛能量代谢负平衡性疾病，能量代谢主要指征物质（谷氨酰胺、血糖、BHBA和NEFA）通过细胞免疫和体液免疫两种途径抑制机体免疫反应，导致机体免疫抑制。牛奶作为奶牛最主要的体液（牛奶、尿液、血液），也是最容易获得的体液和最理想的诊断样品，具有重要的免疫功能。项目组旨在通过对酮病奶牛初乳的免疫蛋白组学图谱的研究，展示牛奶免疫蛋白成分数量和组成的变化，阐明酮病状态下奶牛的免疫机能状态；寻找与酮病相关的免疫分子，建立免疫分子与疾病之间的关系，开发潜在的新的监测方法。为探讨酮病奶牛围产期能量代谢负平衡状态对乳汁蛋白组学的影响，明确酮病奶牛能量代谢负平衡与乳汁蛋白组学变化特征之间的关系，并获得酮病奶牛乳汁蛋白组学图谱，寻找酮病奶牛乳蛋白中的早期监测标志物。本项目通过非标定量（Label-Free）蛋白组学方法，对酮病奶牛乳脂球膜蛋白和乳清蛋白分别进行检测，结合生物信息学分析，获得了奶牛乳汁全蛋白图谱，并分析了酮病对牛乳蛋白组成的影响。实验结果显示酮病奶牛的乳脂球膜蛋白组分有402个蛋白上调和308个蛋白下调，乳清蛋白组分有22个蛋白上调和313个乳清蛋白下调。通过检测健康奶牛和酮病奶牛发病前与发病后乳汁中乳脂球膜蛋白的炎症相关蛋白与血液中能量平衡指标及代谢产物生化指标，明确了奶牛酮病与围产期炎症相关代谢通路存在关联，且导致了炎症相关乳脂球膜蛋白的变化，引发围产期奶牛乳腺炎症反应。并提出了在酮病发病前观察到的ITIH4和CD46增加以及AHSG和ORM1减少可能是识别和监测有酮病风险奶牛的指标。综上所述，围产期奶牛能量代谢状态与免疫相关疾病密切相关，且与机体免疫功能呈密切的负相关性，进行牛奶（初乳）免疫蛋白组学的研究将会对奶牛酮病的预测、预防和诊断具有重要的意义和应用价值。