GLIPR1在慢性阻塞性肺疾病中的作用及其机制

Currently, there is still a lack of biomarkers and efficient treatments for Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Airway inflammation, oxidative stress, and the apoptosis of epithelial and endothelial cells play important roles in COPD. GLI pathogenesis-related 1 (GLIPR1) regulates the apoptosis of cancer cells; however, the role of GLIPR1 in COPD is not clear. In previous studies, we found that the level of GLIPR1 mRNA in plasma exosomes from patients with COPD was significantly higher than that from healthy smokers. GLIPR1 was mainly expressed in the airway epithelial cells, and cigarette smoke compensatorily upregulated the expression of GLIPR1. GLIPR1 knockdown significantly increased the apoptosis of epithelial cells, possibly through the urokinase plasminogen activator system (uPA/uAPR) and/or Keratin 15 (KRT15). Therefore, we hypothesize that GLIPR1 plays an important role in COPD. Using the tethered cationic lipoplex nanoparticle (TCLN) technique, we propose to study the association between the level of GLIPR1 mRNA in the circulating exosomes and the development of COPD and the severity and frequency of COPD exacerbations. Using the Glipr1 knockout mice, we propose to evaluate the role of Glipr1 in airway inflammation and the apoptosis of epithelial cells. Using the Krt15-LacZ reporter mice, we propose to study the role of Krt15 in the development of COPD. Our studies will provide potential pharmacological targets for the treatment of COPD.

目前对慢阻肺仍然缺乏生物标志物和针对呼吸道病理改变有效的治疗措施。炎症反应、氧化应激、及其引发的肺内实质细胞凋亡促进慢阻肺。GLIPRl调控肿瘤细胞凋亡，但其在COPD病变进展中的作用未明。我们前期研究发现，慢阻肺患者血浆中GLIPR1 mRNA阳性的外泌体丰度显著高于健康吸烟人群；GLIPR1主要表达于肺部上皮细胞，烟熏诱导其选择性及代偿性上调；敲减GLIPRl抑制uPA/uPAR和KRT15，引起线粒体介导的细胞凋亡。因此，我们推测GLIPR1在慢阻肺发生发展中具有重要作用。本研究拟利用基于脂质体复合物纳米颗粒生物芯片研究外泌体内GLIPR1 mRNA与慢阻肺急性发作、预后和分级的相关性；通过Glipr1基因敲除小鼠，探讨Glipr1对气道炎症和肺内上皮细胞凋亡的影响及机制；利用Krt15-LacZ基因报告小鼠，研究Krt15在慢阻肺发生发展中的作用，为慢阻肺的防治提供新的思路。

目前对慢阻肺仍然缺乏生物标志物和针对呼吸道病理改变有效的治疗措施。炎症反应、氧化应激、及其引发的肺内实质细胞凋亡或焦亡促进慢阻肺。本项目通过Glipr1基因敲除小鼠和上皮细胞GLIPR1基因敲减，阐明了Glipr1通过Plau/Egfr通路诱导细胞焦亡，加重烟熏引起的气道损伤和炎症反应。.体内实验：利用CRISPR/Cas9技术进行Glipr1基因敲除，获得Glipr1基因敲除小鼠；通过构建小鼠香烟烟熏COPD模型模拟气道炎症，发现Glipr1基因敲除加重烟熏引起的气道损伤、肺部炎症；加重烟熏引起的caspase-1、caspase-3依赖性的细胞焦亡。进一步机制研究，发现Glipr1基因敲除抑制尿激酶型纤溶酶原激活物（Plau）、表皮生长因子受体（Egfr）表达及Egfr磷酸化。Krt15基因敲除加重烟熏引起的气道损伤。多组学扩展性研究，通过对小鼠粪便、肺组织行转录组测序（RNA-seq）、微生物16S、和LC-MS全谱代谢组检测，发现Glipr1基因敲除加重了烟熏引起的小鼠肠道菌群紊乱，烟熏和Glipr1基因敲除均引起肠道代谢异常。.体外实验：烟雾提取物上调GLIPR1在上皮细胞中的表达，GLIPR1基因敲减降低细胞增殖，引起活化的caspase-1增加，GSDMD的N端结构域释放增多，活化的IL-1β含量明显升高，加重香烟提取物诱导的caspase-1依赖性的细胞焦亡。进一步机制研究，发现上皮细胞GLIPR1基因敲除抑制PLAU、EGFR表达及EGFR磷酸化；PLAU基因敲除抑制EGFR表达；PLAU基因过表达促进EGFR表达及其磷酸化，减轻香烟提取物诱导的细胞焦亡。KRT15基因敲除显著抑制上皮细胞增殖。.临床研究：我们首先开发脂质体纳米颗粒负载生物芯片技术，采用纳米脂质体和分子探针结合的方法，检测血浆中单个外泌体内的mRNA等核酸，通过收集21例健康吸烟人群和39例稳定期COPD患者外周血，发现COPD患者血浆中GLIPR1 mRNA阳性的外泌体丰度显著高于健康吸烟人群。第二阶段我们开发了高通量纳米生物芯片液体活检系统，实现同时识别单个外泌体表面的膜蛋白、以及外泌体内含的核酸，通过收集29例健康吸烟人群和83例稳定期COPD患者外周血，通过血浆样本分析发现，在COPD患者血浆中GLIPR1膜蛋白阳性的外泌体丰度显著高于健康吸烟人群。