多囊卵巢综合征新的小鼠模型的构建及机制研究

Polycystic ovary syndrome (PCOS), one of the most common reproductive endocrine disorders affecting reproductive women, is characterized by hyperandrogenism, polycystic ovary morphology, and oligo- or anovulation. Due to its unclear pathogenesis and mechanisms, PCOS is still a clinical difficulty and under much investigations. Presently available PCOS animal models are induced based on one of its clinical manifestations, but can not reflect all, which may be resulted from a failure to mimic its pathogenesis. In our preliminary study, we found that Protein C receptor (PROCR)-expressing granulosa cells were important for follicular development. Targeted ablation of PROCR+ granulosa cells led to accumulation of small follicles, anovulation, and hyperandrogenism, symptoms quite similar to PCOS. Also, the proportion of PROCR+ granulosa cells of PCOS patients was significantly lower than that of control. By manipulating critical genes of granulosa cell, we will establish a novel suitable mouse model for PCOS research. We will further investigate the role of PROCR+ granulosa cell in follicular development and PCOS pathogenesis. Our project will elucidate the function and molecular mechanisms of PROCR in follicular development and PCOS, establish a novel mouse model for PCOS research, and provide new insights for PCOS treatment.

多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄女性最常见的生殖内分泌疾病之一，迄今发病机制欠清。现有动物模型均基于模拟PCOS患者的某个病理表型，而无法完全反映其他特征，很可能是因为所采取的诱导方法没有对疾病发生的原因进行模拟。本研究组初期研究发现：蛋白C受体（PROCR）表达的颗粒细胞对卵泡发育有重要的作用；剔除PROCR阳性颗粒细胞后小鼠呈现出小卵泡数量增加、无排卵、雄激素水平升高等类似PCOS的表现；在PCOS病人卵泡中同样发现了PROCR+颗粒细胞比例的降低。本项目将针对在卵泡发育和PCOS发病中起关键作用的颗粒细胞，操纵其关键基因，建立一种更贴近PCOS临床表现的动物模型；深入考察PROCR阳性颗粒细胞在卵泡发育中的功能和性质；探讨PROCR及其下游信号通路在PCOS发病中的作用。研究结果将揭示PCOS发病过程中可能的分子调控机制，建立全新的PCOS小鼠模型，为PCOS的治疗提供重要理论基础。

我们前期研究发现蛋白C受体（protein C receptor, PROCR）在卵巢上皮细胞中可作为前体细胞标记，PROCR可激活PI3K/AKT、ERK等多条卵泡膜发育的重要信号通路，PROCR分子可作为卵泡发育以及卵子发育障碍导致的不孕症的潜在重要作用靶点。.通过原位杂交及免疫荧光染色发现PROCR在小鼠的卵巢各级卵泡的颗粒细胞中表达。EdU染色及原代细胞体外培养实验提示PROCR+颗粒细胞较PROCR-颗粒细胞有更高的增殖能力。ELISA测定提示PROCR+颗粒细胞培养基中的雌激素和孕激素水平较对照组降低。我们构建了Procr-CreERT2;Rosa26-DTA条件性敲除小鼠，通过注射他莫昔芬诱导靶向性敲除PROCR+细胞。PROCR+细胞敲除的小鼠出现了无排卵以及卵巢多囊样改变的现象，血清雄激素水平升高，AMH水平、LH/FSH比值明显升高，芳香化酶的表达明显降低，超促排卵后获得卵子数目较对照组增多，但因未完全成熟而受精失败。以上结果均符合多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS）的临床表现。我们在临床上收集了17对正常对照和PCOS病人的颗粒细胞样品，PCOS病人的PROCR+颗粒细胞比例明显低于对照，进一步验证了PROCR+颗粒细胞的异常可能与PCOS的发病相关。我们利用shRNA技术在人卵巢颗粒细胞系（KGN细胞）中敲低PROCR的表达，EdU染色及细胞传代实验提示：敲低PROCR的表达将抑制颗粒细胞增殖，并导致CYP19A1、ESR2、FSHR、LHCGR基因表达上调，雌、孕激素水平升高。WesternBlot结果显示敲低PROCR的表达会导致AKT、ERK磷酸化水平的显著降低，加入PROCR激动剂的细胞蛋白AKT、ERK磷酸化水平显著升高，证明PROCR参与AKT、ERK信号通路的激活。.综上所述，我们首次在卵巢颗粒细胞上发现了PROCR的表达，PROCR+颗粒细胞较PROCR-颗粒细胞有着较高的增殖能力和较低的分化水平。进一步研究提示，PROCR+颗粒细胞在卵泡发育过程中可能是通过调控PI3K/AKT和ERK信号通路发挥作用，其异常与多囊卵巢综合征的发病密切相关。同时，我们建立了全新的良好模拟生殖、代谢两方面PCOS表型的小鼠模型，弥补了以往研究手段的不足。