基于SISCAPA-MRM技术的定向蛋白质组学在肝癌血清生物标志物验证研究

Hepatocellular carcinoma (HCC) is is one of the most common malignant tumors in China. The rates of HCC misdiagnosis and missed diagnosis are unsatisfactory using AFP as biomarker solely. Cumulatively, integrating multiple factors for HCC prognosis is an inevitable trend to improve the accruacy of early HCC diagnosis. Currently the main clinical test using immunological methods rely on high quality.antibody, an experiment can only detect one protein. It is difficult to meet the need of biomarker verification. MRM can analyze multiple biomarkers in one sample with high specificity without antibody, which showed great superiority on biomarker verification and validation. Although MRM has been accepted in biomarker verification, the broad application of this method in large-scale biomarker verification has been prevented due to the poor sensitivity. Combined the target peptide enrichment technology of SISCAPA, the sensitivity can improved to ng/mL level. The purpose of this thesis is to establish a universal SISCAPA-MRM quantitative method for biomarkers verification. Then apply this method to the study of target potential biomarker validation, which came from our early study and reported in the literature. And clinical data were retrospectively studied, Logistic regression analysis to calculate the ROC of single biomarker and multiple biomarker. ROC analysis was used to evaluate the effieacy of one biomarker and multiple biomarker, and to further explore the early diagnosis of hepatocellular carcinoma combined value of different markers.

肝癌是我国最常见恶性肿瘤之一，仅仅依靠AFP的单指标诊断容易造成误诊和漏诊，多个肿瘤标志物的联合检测已经成为必然趋势。目前临床检验主要采用依赖高质量抗体的免疫学方法，一次实验仅能检测一个蛋白。难以满足数量众多的肝癌标志物候选蛋白的验证工作。而质谱多反应监测技术，不依赖于高质量的抗体，可以对复杂样本进行多个蛋白质同步测定，是理想的替代技术。本项目将在已建立的MRM定向蛋白质组学检测方法的基础上，拟结合SISCAPA的目标多肽富集技术，将联测灵敏度提高到ng/mL级，最终建立一种高灵敏度、高通量、快速的多标志物联合检测方法。然后将此方法应用于文献报道和课题组前期研究的共40种肝癌标志物候选蛋白临床样本验证工作中。并对临床资料进行回顾性研究，Logistic回归分析，计算单指标和联合指标的ROC，得到最优的肝癌标志物组合，并进一步探讨不同标志物联合对肝癌早期诊断的价值。

肝细胞癌是目前世界上致死率最高的恶性肿瘤之一，诊断主要血清生物标志物AFP检测结合影像学检查。但是大量的肝癌血清标志物均为非特异性的肿瘤相关蛋白，作为诊断指标单独使用时，其敏感性和特异性有限，单一肿瘤标志物的检测并不能反映肿瘤的整体性质，多个标志物的联合检测成为必然趋势。.课题组开发了基于MRM的靶向蛋白质组学检测方法，该方法结合SISCAPA的目标多肽富集技术，适合临床样品的检测。具有MRM-MS技术的高通量、高特异性，敏感性和准确性，也同时保持了SISCAPA技术的研发时间短、成本低的特点，特别适合疾病的多个标志物的联合检测。课题组所建立和优化的方法经过重复数据评价，结果显示该方法定量结果稳定、可靠、具有重复性。并将此方法应用于肝癌候选标志物的临床样本验证工作中，检测收集到的肝癌患者的多个目标蛋白，计算标志物的灵敏度和特异性，阳性预测值和阴性预测值，评估这些潜在的肝癌标志物诊断肝癌价值以及分析与临床相关性。并对临床资料进行回顾性研究，Logistic回归分析，计算单指标和联合指标的ROC，得到最优的肝癌标志物组合，并进一步探讨不同标志物联合对肝癌诊断的价值。.研究发现MCM3与肝细胞癌的临床分期密切相关，其ROC曲线AUC为0.932，MCM3值与肝癌患者的短期总生存率（OS）和无复发生存率（RFS）密切相关。MCM3与其他相互作用蛋白（MCM2、MCM5、CHK1和DHX9）的联合使用，可以提高的特异性和敏感性，具有更好的HCC诊断能力；RAD52也是有潜在的肝癌标志物，表达量与肝细胞癌患者的短期总生存率（OS）和无复发生存率（RFS）无关。其单独的ROC曲线AUC为0.704，结合RAD52相互作用蛋白（RAD51、XRCC6、CFL1），具有更高的特异性和敏感性。细胞实验发现，过表达的RAD52能显著促进Huh7细胞的增殖和迁移。.本项目的研究有助于突破生物标志物在发现、验证和确认过程中存在的瓶颈，产生不依赖特异性抗体，并且具有高通量、高特异性和敏感性的检测方法。在肝细胞癌的研究也有利于验证肝癌的标志物及相应的机制研究。