肝癌血清标志物的质谱多反应检测与验证研究

肝癌是广西第一位癌症杀手。寻找有效的肿瘤标志物用于癌变机理研究、疾病的早期诊断及高危人群的筛查具有重要意义。本课题在前期利用SELDI技术CLINPROT筛选肝癌与正常人血清差异蛋白的基础上，Tricine-SDS- PAGE凝胶电泳分离纯化差异蛋白，LC－MS/MS初步鉴定标志蛋白。利用QTRAP质谱系统MIDASTM工作流程对LC－MS/MS初步鉴定标志蛋白进行定性与定量验证与确认。针对确认的标志物制备单克隆抗体，构建肝癌血清标志物检测试剂盒。利用该试剂盒检测肝癌和对照人群血清标志物水平的差异，分析血清标志物检测诊断肝癌以及与AFP检测联合诊断肝癌的灵敏度和特异度。课题的研究结果将为肝癌的流行病学研究提供系列可靠的血清标志物，提高肝癌血清诊断的灵敏度和特异度，对进一步阐明肝癌发病机制和防治广西高发地区的肝癌具有重要意义。

肝癌是广西第一位癌症杀手。寻找有效的肿瘤标志物用于癌变机理研究、疾病的早期诊断及高危人群的筛查具有重要意义。本项目在前期利用SELDI，CLINPROT筛选肝癌血清潜在标志物的基础上,建立iTRAQ标记结合MALDI-TOF/ TOF筛选和鉴定血清标志物的方法，利用该方法筛选和鉴定肝癌/肝炎差异表达蛋白71个；肝癌/肝纤维化差异表达蛋白22个；利用跨种属策略，生物信息学筛选出人类和小鼠在肝癌发生发展过程中的共同表达基因52个，富集出7条通路，其中甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢通路和轴突引导通路与肝癌发生发展密切相关通路；筛选出人类和大鼠人类与大鼠在肝癌发生发展过程中的共同表达基因26个，富集出粘附斑通路，与肝癌的发生发展密切相关。将SELDI，CLINPROT，跨种属策略筛选到的潜在标志物分别与iTRAQ标记结合MALDI-TOF/ TOF筛选和鉴定血清标志物进行综合聚类分析，得到的共性表达蛋白进行细胞和组织验证后，再利用本项目建立的QTRAP质谱系统MIDASTM工作流程对血清标志物进行MRM验证，确认6个血清标志物。针对确认的标志物制备抗体，构建肝癌血清标志物ELISA检测系统。利用该系统检测肝癌和对照人群血清标志物水平的差异，分析血清标志物检测诊断肝癌以及与AFP检测联合诊断肝癌的灵敏度和特异度。根据联合诊断结果提出了AFP联合其中两个标志物建立肝癌高发人群筛查程序方案。利用该筛查程序，可明显提高在AFP≤25ng／ml人群中肝癌病人的检出率。课题的研究结果如能进一步得到多中心临床验证和流行病调查研究的支持，对高发区肝癌的防治有重要作用；同时本项目筛选和鉴定肝癌/肝炎，肝癌/肝纤维化差异表达蛋白，跨种属策略筛选肝癌发生发展过程中的共同表达基因和富集出与肝癌发生发展密切相关通路，为深入研究肝癌血清标志物奠定了良好基础，经功能验证后的差异表达蛋白可进一步丰富和完善上述肝癌高发人群筛查程序；本项目建立的QTRAP质谱系统MIDASTM工作流程，为进一步利用QTRAP质谱系统开发大规模高通量绝对定量肝癌血清标志物研究提供了关键技术支持。