基于血清蛋白组学和血液转录组学的孤独症谱系障碍诊断生物标志物筛选和验证

Autism spectrum disorder (ASD) is a complicated genetic neuropsychopathic disease with heterogeneity. The diagnosis of ASD is mainly depended on clinical symptoms. It is urgent to find a quantitative biological marker. Our early study indicated that serum proteomics was an effective means which could quantitatively diagnosis ASD. We intend to research 60 cases ASD and 60 matched healthy children and detect the expression of 55 ASD related genes by Realtime PCR in the blood，then analysis the value in diagnosis of Han population in China combined with clinical data. We screen protein markers related to ASD by serum proteomics method and establish proteome analytical model.After identified identify differential protein by tandem mass spectrometry,we construct biological information signal network of ASD. In order to lay the clinical quantitative biomarkers foundation for ASD, we establish the serological diagnostic methods by monoclonal antibody preparation technology and farther confirm using patients specimens which are different degree of disease.

孤独症谱系障碍（ASD）是一类具有遗传异质性的复杂神经精神障碍性遗传疾病，由于诊断标准以症状描述为主，因此存在争议，亟需筛选可量化生物学诊断指标。本研究小组在前期预实验研究中发现，血清蛋白组的方法是筛选ASD可量化生物学诊断指标的有效手段。本研究拟收集60例ASD患儿以及60例年龄、性别匹配的健康儿童的血清和血液，应用实时定量PCR检测血液中55个ASD相关基因在患者血液中的表达，结合临床分型资料，分析其在汉族患者人群中的诊断价值；应用血清蛋白组学的方法筛选ASD相关的蛋白质血清标记物，建立ASD血清蛋白组分析模型；通过串联质谱来鉴定差异蛋白，构建血清蛋白组ASD生物信息信号网络；应用单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体,并用患者血液标本按疾病严重程度分层进一步验证，为ASD量化生物标记物的临床应用奠定基础。

孤独症谱系障碍(ASD)可量化生物学指标的研究对该病的诊治意义重大。研究采用：1）MAL-Ⅱ-磁粒复合物分别富集ASD及其年龄相配健康儿童血清中MAL-II结合蛋白质；2）Agilent 公司LCQ-6330 离子阱二级串联质谱仪分析分离的复杂样品中的多肽；3）非标记定量分析比较ASD血清及健康对照血清中各蛋白质表达量；4）KEGG数据库和STRING数据库在线构建ASD血清中MAL-II结合蛋白基因信号通路；5）蛋白质印迹法分别对其中两种蛋白质（转铁蛋白和补体蛋白8B）在ASD和健康对照儿童血清样本中表达量进行验证。得出以下结果：1）富集蛋白质条带清晰，与血清总蛋白相比有个别蛋白条带显示明显富集；2）ASD血清和质谱分别鉴定到1223和1185个单一多肽对应的245和229个蛋白，其中95.6%蛋白质为数据库已注释蛋白质。通过GO生物过程注释，其中11%蛋白质参与生物粘附，10%蛋白质参与定位过程，其余还参与信号传导、增殖、免疫系统等过程。分子功能注释显示50%蛋白质具有结合功能，其余还包括受体活性、酶调控制活性、催化活性等。在结合功能中67%为蛋白质结合功能，25%为糖结合功能，另外还包括多肽结合，离子结合等功能；3）分别有58种和46种蛋白质特异存在于ASD血清和健康对照血清中，有25种蛋白质在ASD血清中表达上调，其中包括补体C5、激肽原-1等；而18种蛋白质在ASD血清中表达下调，其中包括脂多糖结合蛋白、肽酶抑制剂16等；4）35种蛋白质参与补体系统和凝血级联反应、16种蛋白参与全身性红斑狼疮疾病通路等；5）转铁蛋白和补体蛋白8B在ASD血清中表达显著上调。这些结果得到以下结论：1）成功富集出ASD的MAL-II结合蛋白质；2）质谱鉴定MAL-II结合蛋白质参与多种生物学过程，并担负重要分子功能；3）ASD血清中差异表达MAL-II结合蛋白有可能成为其潜在指标；4）MAL-II结合蛋白与人体自身免疫系统密切相关；5）转铁蛋白和补体蛋白8B可能作为ASD血清潜在标记物进行大样本量验证。项目执行期间国际学术期刊投稿2篇，培养博士后1名。