消去化修饰蛋白质的鉴定

Protein eliminylation is defined as a post-translational modification that eliminates the side chain of amino acid and results in an unsaturated amino acid(an alkene), such as dehydroalanine or dehydrobutyrine, by β-elimination. All the known eliminylated peptides have special biologic activity, such as antibiotic lantibiotics,thiopeptide antibiotics and microcystin toxins..Protein eliminylation is also crucial to the regulation of some cellular processes..Oxidative conversion the active site selenocysteine to dehydroalanine results in irreversible inactivation of glutathione peroxidase,eliminylation of MAPKs catalyzed by phosphothreonine lyases irreversibly down-regulats MAPK pathways. Adducts of unsaturated amino acid with cysteine,lysine or histidine side chains have been identified from a range of sources, and certain LanC-like proteins share structural, mechanistic or sequence homology to nisC, so that eliminylation might be a widespread regulatory modification. Under an extensive understanding of the chemical properties of α，β-unsaturated amino acid, we designed chemical probes to special labeling and purification of eliminylated protein, identification the modification sites by mass spectrometry, and analysis the preliminary biological function of the modified proteins and peptides.

蛋白质消去化修饰，是通过β-消去反应修饰氨基酸的侧链，生成含不饱和碳-碳双键氨基酸的特异性蛋白质翻译后修饰。目前已经发现的消去化修饰蛋白质和多肽，许多都具有特殊的生物学活性，如lantibiotics和thiopeptide antibiotics的抑菌活性，microcystins的毒性等；或者对蛋白质的功能以及信号通路具有特殊的调控作用，如Glutathione peroxidase的消去化修饰导致酶活性降低，MAPK激酶的消去化修饰不可逆抑制MAPK激酶介导的免疫信号通路。这种修饰很可能在体内比较常见，因为不饱和氨基酸与其它氨基酸的亲和加成产物在一些组织中比较常见，而体内也存在催化该类加成反应的酶的同源物。本项目利用对α，β不饱和羰基化合物的化学性质的深入了解，设计化学探针，特殊性地标记不饱和氨基酸，纯化标记蛋白后用质谱鉴定修饰位点，并初步分析修饰蛋白和多肽的生物学功能。

蛋白质消去化修饰是一种罕见的特殊翻译后修饰。这种修饰通过磷酸丝/苏氨酸的β-消去，丝/苏氨酸的脱水，半胱氨酸的脱羧以及氧化消去而生成烯烃（其主要产物是脱氢丙氨酸和脱氢丁氨酸）。已经发现的该类消去化修饰多肽产物，包括羊毛硫细菌素、硫肽类抗生素以及微囊藻毒素等都具有特殊的生物学活性；已经发现的蛋白质消去化修饰，如磷酸苏氨酸裂合酶对MAPKs的消去化修饰，具有重要的调节功能。因此通过筛选并鉴定消去化修饰蛋白和多肽的新成员，将为新的生物活性多肽的发现与开发，以及具有重要活性或调节功能的蛋白质的发现与功能研究，提供理论基础。.首先根据α，β不饱和羰基化合物发生Michael 加成以及Diels-alder反应的原理设计并合成各种化学探针，并在反应体系、缓冲液种类、PH值、温度、变性剂种类和浓度等方面进行优化，找出最适反应条件并筛选出最灵敏、特异的化学探针；其次将化学探针与细胞裂解液反应后，分离纯化标记上探针的蛋白或多肽，质谱鉴定消去化修饰蛋白质以及修饰位点并初步分析其生物学功能。.我们发现有一种化学探针对消去化修饰的MAPKs能进行特异性的标记。通过对于反应条件进行优化，验证了反应的灵敏性和特异性。利用上述标记条件，对于消去化修饰的MAPKs、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（salmonella）、志贺氏菌（Shigella flexneri）、牛脑裂解液、斑马鱼裂解液、酵母裂解液及组蛋白（Histone）进行了标记、分离纯化和质谱鉴定。对消去化修饰的MAPKs二级质谱鉴定位点表明该化学探针特异性的标记在发生消去反应的位点上；从大肠杆菌鉴定到一百多种潜在修饰的蛋白质和多肽，牛脑裂解也鉴定到几十种具有潜在修饰的蛋白质和多肽。表明消去化修饰是一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰，可能在生物体的生命活动中扮演十分重要的角色。