新型丝氨酸蛋白酶抑制剂MDSPI16的分子修饰及其抗炎活性检测

Anti-inflammatory drugs have become the second common medicine category only to anti-infectives in our country’s animal clinic and often cooperate with other drugs to treat the fever and viral diseases caused by various factors. At present, the existing anti-inflammatory drugs for animal not only have very single varieties but significant side effects. Thus, it is of urgent need to develop a novel anti-inflammatory agent for animal with strong anti-inflammatory activity, long half-time and few side effects. Our project team has successfully selected a novel serine protease inhibitor coding gene（MDSPI16）from a housefly larvae suppression subtractive hybridization library constructed previously. The protein encoded by the MDSPI16 exerts strong anti-inflammatory activity but the bigger molecular weight makes it much prone to immune response. Hence, in this study, molecular dynamics simulation was performed to determine the active binding pockets and residues based on molecular bioinformatics; The truncated proteins under the premise of not impacting anti-inflammatory activity will be constructed; A modified library will be constructed by MDSPI16 modification using polyethylene glycol of various chain length and different molecular weight; The inhibitory activity of different MDSPI16 single conjugates to elastase will be measured by purifying and identifying single coupled products and the anti-inflammatory activity be further detected by establishment of neutrophil inflammation model and lung injury model of mice. The results above will lay the foundation for research and development of novel anti-inflammatory drugs.

抗炎药已成为我国动物临床仅次于抗感染药的第二大类常用药，常配合其他药物治疗各类因素引起的发热及病毒性疾病。目前，我国现有动物用抗炎药品种单一、副作用明显，故而研发抗炎活性强、毒副作用小、半衰期长的新型动物专用抗炎药迫在眉睫。项目组已成功在构建的家蝇幼虫抑制性消减杂交文库中筛选获得一个新型丝氨酸蛋白酶抑制剂编码基因（MDSPI16），该基因编码的蛋白具有强抗炎活性，但其分子量较大，临床应用易产生免疫反应。为此，本研究将采用分子生物信息学技术，通过动力学模拟确定重要活性口袋和残基，在不影响其抗炎活性的前提下构建截短蛋白；采用不同链长、不同分子量的聚乙二醇对其进行修饰，构建不同构象的修饰文库；进而在对单偶联产物进行纯化和鉴定的基础上确定其不同单偶联产物对弹性蛋白酶的抑制活性，并通过构建中性粒细胞炎症模型和小鼠肺损伤模型对其抗炎活性进行检测。上述研究成果将为新型抗炎药物的研发奠定基础。

我国现有动物用抗炎药品种单一、副作用明显，研发抗炎活性强、毒副作用小、半衰期长的新型动物专用抗炎药迫在眉睫。项目组以前期筛选获得的具有强抗炎活性的新型丝氨酸蛋白酶抑制剂MDSPI16为基础，通过生物信息学分析确定其重要活性口袋和残基，构建截短蛋白，并进行抗炎活性测定；利用蛋白质结构分析软件确定MDSPI16修饰位点，采用不同链长、不同分子量的聚乙二醇（PEG）对其进行修饰，构建修饰文库，确定最佳修饰条件；对单偶联修饰产物进行筛选、纯化，确定其对弹性蛋白酶的抑制活性；通过构建中性粒细胞模型和小鼠肺损伤动物模型对其抗炎活性进行检测；采用蛋白酶解法与高分辨质谱法相结合测定半衰期；采用间接ELISA法测定免疫原性。研究结果如下：（1）构建的5个截短蛋白及合成的32条截短肽对弹性蛋白酶均无抑制作用，未获得抗炎活性接近或强于MDSPI16的丝氨酸蛋白酶抑制剂。（2）成功构建MDSPI16的PEG修饰文库，最优修饰工艺为pH6.35、mPEG-SPA：MDSPI16摩尔比为42.786、MDSPI16蛋白浓度为1.883mg/ml，此条件下单位点修饰率为63.969%。（3）单偶联修饰产物对弹性蛋白酶的活性具有抑制作用（IC50=86nM），能有效治疗由LPS诱导的小鼠急性肺损伤，减轻炎症细胞的浸润，显著降低促炎因子（IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2、TNF-α）的表达量以及显著提高抗炎因子IL-10的表达量，其抗炎活性与Sivelestat相当。（4）经PEG修饰后，MDSPI16体外稳定性增强，且无细胞毒性、无胚胎毒性，对小鼠心、肝、肾等器官无毒副作用。体内血浆半衰期由4.33h延长到7.1h，免疫原性降低至原来的62.5%。本项目获得了抗炎活性强、半衰期长、免疫原性低的新型抗炎蛋白mPEG-SPA-MDSPI16，为新型抗炎药物的研发奠定基础。