凝血因子丝氨酸蛋白酶催化活性的分子动力学研究

Serine protease is an important type of enzyme, and its Ping-Pong mechanism is a classic model of catalysis accomplished by delicately arranged reactive site residues. The coagulation factors FVIIa、FIXa、FXa、FIIa, could be typical models of this type of enzyme. It is of great significance in science and applications to study on the molecular mechanism of their catalysis and regulations, especially the similarities and differences in their catalytic activities and specificities, as well as the physical, chemical and structural reason for them. In addition to structural determination and biochemical analysis, molecular dynamics simulations would be helpful to reveal the details in scale of nanometers and nanoseconds during this process. Although many computational biological methods have been more and more applied into this problem, there are no quantitative calculations on the catalytic reactions to explain the effects on their activities. Therefore, the applicants plan to use QM/MM molecular dynamics simulations to compute on the catalytic reactions of these coagulation factors in different configurations or conformations, together with bioinformatic analyses, enzyme kinetics and FRET experiments, so as to explore possible relationship between the structures, conformational changes and their catalytic functions. The results could also be utilized by structure-based rational design of coagulation factors for medical applications.

丝氨酸蛋白酶是一种重要的催化酶类型，其乒乓反应机制更是复杂反应过程的经典。作为一类典型的丝氨酸蛋白酶，FIIa、FVIIa、FIXa、FXa等关键凝血因子的催化过程和其调控机制的共性与差异，及其产生的物理、化学和分子结构机理，对于理解进而设计改造此类蛋白酶具有重要科学意义。在结合结构解析和生物化学实验的基础上借助分子动力学模拟方法探索其催化活性在纳米和纳秒尺度上的微观细节，有助于加深对此问题的认识。虽然多种计算方法已经在此问题上得到越来越多的应用，然而目前还没有直接定量计算催化反应过程从而解释催化反应活性的研究。因此申请人拟利用QM/MM分子动力学模拟方法计算这几种活性凝血因子在多种构型和构象条件下的酶解催化过程，结合生物信息学分析、酶动力学分析和荧光共振能量转移实验验证，以探索其中催化位点及重要区域的结构、构象动态变化与催化功能之间的关系，并为理性设计改造凝血蛋白，开发药物提供理论基础。

丝氨酸蛋白酶是一种重要的催化酶类型，其乒乓反应机制更是复杂反应过程的经典。作为一类典型的丝氨酸蛋白酶，FIIa、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa等关键凝血因子的还存在复杂的激活和调控机制，理解其分子结构机理，对于理解进而设计改造此类蛋白酶或其靶向药物具有重要科学意义和临床价值。.在本项目中，结合临床发现、计算生物学模拟分析与体外实验验证，我们对FIIa、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa等重要凝血因子的丝氨酸蛋白酶催化结构域的不同重要位点的突变对于底物特异性和催化活性的调控作用的分子机制，进行了研究。（1）针对N端柔性激活片段与激活口袋的相互作用，我们发现非保守的Cys27突变打破Cys22-Cys27二硫键影响N端片段的柔性运动，进而影响了FXa的激活。对FIIa、FVIIa、FIXa、FXIa的N端片段的计算也发现相似的柔性运动但各不相同的调控作用，与N端片段及激活口袋周边的残基均有关联。（2）活性口袋中不论是配体药物小分子还是底物多肽，都存在动态的结合方式，从而影响周边残基的作用，对于基于结构的药物设计有着一定的借鉴意义。（3）对于凝血因子蛋白复合物的相互结合界面上的作用机制我们也展开了一些研究，发现FII凝血酶的Arg541Trp并不是影响其与抗凝血酶(AT)的结合，而是影响蛋白C(PC)的活化。还发现一种新型FIXa单克隆抗体不是中和FIXa的催化活性位点而是倾向于竞争性结合FIXa与FVIII的结合面，从而抑制生理条件下FVIII对FIXa的激活。.本项目的主要内容虽然是基础研究，但与临床需求结合十分紧密。上述结果除了对于重要凝血因子的动态分子运动、构象变化及与配体的结合产生了更深入的认识，为以此为基础开发相关药物提供了新的思路，还对于若干新型临床病例的机理解释和治疗方案的指导产生了重要的作用。