临床分离牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌多重耐药机制确证

At present, the main pathogen of Cattle hemorrhagic sepsis that serious harming cattle industry in China is bovine capsular serotype A Pasteurella mutocida. Due to the pathogen's lower Interactive immune protective rate, cattle hemorrhagic sepsis was treated mainly by using antibiotics. With the widely and irrational use of antibiotics, the multiple drug-resistance of the bacteria to the common antibiotics has become widespread. Drug-resistance of bovine capsular serotype A Pasteurella mutocida to antibiotics may be linked to chromosome gene mutations, plasmid mediated resistance and excessive expression of efflux systems. The Project intend to test the drug resistance of nearly 100 strains of bovine capsular serotype A Pasteurella mutocida clinical separated, further sequence the genome and plasmid of multiple drug-resistant strains clinical separated, predict the function of its Coding genetic sequence, confirm its function, and finally determine whether there are gene mutations and \ or chromosome plasmid mediated multiple drug-resistant mechanism. Through testing the changes of concentration of drugs in bacteria before and after joining proton pump inhibitor, analyzing the possible efflux system coding genes by using the bioinformatics software, and confirming the gene expression level and its multiple resistance level relations With fluorescent quantitative PCR technology, The Project was intend to clarify to some extent the multiple drug-resistance mechanism of bovine capsular serotype A Pasteurella mutocida clinical separated in China, to lay a foundation for trying to inhibit its resistance.

目前严重危害我国养牛业的牛出血性败血症病原主要为牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌。由于该病原菌间的交互免疫保护率低，临床上主要采用抗生素对牛出血性败血症进行治疗。随着抗生素的广泛及不合理使用，该菌对常用抗生素多重耐药的现象已十分普遍。牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌对抗生素耐药可能与染色体基因突变、质粒介导或其主动外排系统过量表达有关。本项目拟对近百株临床分离牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌进行耐药性检测，进而对其临床分离多重耐药株的基因组及质粒进行测序、编码基因序列功能预测及功能确证，确定有无染色体基因突变和\或质粒介导的多重耐药机制；通过测定加入质子泵抑制剂前后菌体内含药量变化、采用生物信息学软件分析其可能存在的主动外排系统编码基因及采用荧光定量PCR确证该基因表达水平与其多重耐药水平关系，在一定程度上阐明我国临床分离牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的多重耐药机制，为设法抑制其耐药性奠定基础。

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌是引发牛呼吸系统疾病的主要病原之一，该病原已对常用抗菌药物呈高度耐药性，严重威胁了我国肉牛产业的健康可持续发展，但有关该病原耐药机制的研究还鲜有报道。本课题对经东北三省进行“北牛南调”的育肥架子牛进行跟踪监测，在明确牛A型多杀性巴氏杆菌感染情况的基础上，对病原菌进行分离鉴定、耐药性检测及耐药风险分析，进一步采用全基因组高通量测序、荧光定量PCR、多联质谱、转录组测序等技术对耐药菌的耐药机制进行研究。. 研究结果显示：（1）我国6个省份分离的牛荚膜A型杀性巴氏杆菌对常用药物敏感性已下降，耐药谱逐年增宽，且发现耐药菌有随育肥牛的跨省转运而发生转移的风险。（2）多重耐药菌基因组存在多个耐药插入基因，与国外分离的耐药菌有较大差异，其耐药整合子基因盒较单一，同时，所分离菌均存在耐药性质粒，但质粒拷贝数较低。（3）牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌对喹诺酮类、大环内酯类药物的耐药机制主要受药物靶位突变介导，其中gyrA基因存在单点突变的菌株存在对喹诺酮类药物耐药的风险，且gyrA83位，parC 80，84位同时突变，可降低药物与靶位作用力，导致该菌高度耐药，大环内酯类耐药菌仅存在23S rRNA2059位的碱基置换，不存在其他耐药基因。（4）药物外排泵在一定程度上介导了喹诺酮类药物的耐药性，其中编码药物外排蛋白的mexV基因和MexV蛋白在亚抑菌浓度恩诺沙星作用下表达量均发生了上调。（5）恩诺沙星和替米考星都可诱导耐药牛A型Pm发生SOS应答反应，但与其不同源性细菌SOS应答系统代谢通路有所区别，其lexA、ssB、recO、ruvA等基因发生了显著上调。. 受项目资助共发表SCI收录文章2篇（还有三篇英文文章正在小修和投稿过程中），国家重点期刊收录文章6篇，共培养硕士研究生5名，博士研究生1名。. 总之，本项目较好的完成了资助项目计划书中的预期目标，阐明了我国分离的牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌的耐药表型、耐药基因型及对常用抗菌药物的耐药机制，对指导临床科学合理应用抗生素、防止耐药株产生具有重要意义，同时也为寻找潜在抗菌作用靶点、有效防治牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌感染提供了新的思路和理论依据。