不同病原体诱导家蝇幼虫前后差异基因功能的研究

家蝇能够传播多种疾病却不被感染，说明家蝇体内可能含有强效抗病活性物质。本项目旨在对两种病原体诱导家蝇后产生的可能编码强效抗病活性物质的差异基因的功能进行研究。课题组目前的研究结果表明，采用不同病原体以针刺法诱导三日龄家蝇幼虫后，通过抑制性消减杂交技术可分别获得数百个差异基因片段，通过cDNA末端快速扩增技术可获得数十个完整的差异基因（溶菌酶基因、抗菌肽基因以及未知功能基因等），正在进行上述相关基因的克隆、表达及表达产物的纯化，本项目拟在此基础上进行部分差异基因表达产物体外抗病活性的测定，检测其在动物体外的抗病功能；通过上述基因表达产物在动物体内抗病及增强免疫机能活性的测定，确定差异基因在动物体内的抗病功能，以期筛选得到强效抗病基因；并进一步对筛选到的差异基因的核苷酸及氨基酸序列进行分析，为家蝇抗菌肽的分子改良提供借鉴，为阐明家蝇幼虫抗病机制及采用基因工程手段制备有效的疾病防治药物奠定基础。

课题组采用临床分离的猪肺炎支原体以针刺法诱导三日龄家蝇幼虫，通过抑制性消减杂交技术成功地构建了猪肺炎支原体诱导家蝇幼虫前、后的抑制性消减杂交文库，获得了数百个诱导前、后差异基因片段；通过cDNA末端快速扩增技术获得了19个完整的目的基因；通过T-A末端连接技术得到上述19个目的基因的重组阳性克隆；通过对克隆基因的DNA测序及与相关基因序列的比较分析，证实19个目的基因中包括4个抗菌肽防御素基因、1个溶菌酶基因和14个未知功能基因，其中的防御素基因、溶菌酶基因与GENBANK中相关基因序列的同源性较高，在GENBANK中未发现14个未知功能基因的同源相似基因序列。. 将获得的阳性克隆质粒和原核表达载体PET28a、PET30a、PET32a分别以限制性内切酶酶切，纯化后，以DNA连接酶连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，经质粒大小、内切酶酶切分析筛选、鉴定重组表达质粒。将阳性重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21感受态中，经IPTG诱导，SDS-PAGE鉴定目的基因的表达，结果表明共有7个目的基因（1个防御素基因，6个未同源基因）获得了表达。. 采用改进的侧带法对获得的目的重组蛋白进行初步纯化后制成冻干粉用于目的基因表达产物的体外及体内功能确证。采用改良后的微量稀释法进行目的基因表达产物体外功能确证实验的结果表明，防御素及3个无同源基因的表达产物具有抗菌活性，其他三个无同源基因的表达产物均未检测到抗菌活性。选用体外试验证实具有较好抗支原体活性的两个无同源基因原核表达产物进行猪气喘病的预防及治疗试验的结果表明，两个无同源基因的原核表达产物对猪气喘病具有较好的预防作用；通过猪肺炎支原体诱导家蝇幼虫前、后获得的其他差异基因的功能尚待进一步研究。 . 受项目资助发表国家重点期刊论文3篇（其中1篇已见刊、2篇被录用），培养硕士研究生2名。. 总之，本项目较好的完成资助项目计划书中规定的研究内容，该项研究成果将为进一步新型抗支原体药物及其他类新型药物的研发奠定了基础。