埃博拉病毒单病毒颗粒荧光示踪及病毒与宿主细胞互作过程的研究

Ebola virus causes severe hemorrhagic fever in humans and nonhuman primates, case-fatality rates in man are as high as 90%. However, there are currently no approved therapeutic countermeasures because few factors about the process and mechanism of virus infection especially the receptors of virus are known. This is the bottleneck of studies on vaccaines and drugs and a serious impact on the epidemic control. In previous studies, we have incorporated the unnatural amino acids into the envelop proteins of infective lentivirus and set up the single virus tracking method based on the gene code expansion; we also incorporated the unnatural amino acid with photocrosslink activity into vesicular stomatitis virus G protein and captured several proteins associated with the process of virus infection. Here, we make a proposal, which is based on the unnatural amino acids incorporation and the single virus tracking method, to study the life cycle of Ebola virus in order to demonstrate the pathogenic mechanism of ebola virus; we also intend to find the receptors of Ebola virus by using photo-crosslinking amino acids, which are incorporated into the envelop proteins of Zaire ebolavirus, to find the targets for anti-Ebola drug development.

埃博拉出血热是由埃博拉病毒导致的人和灵长类动物烈性传染病，病死率高达９０％。但目前埃博拉病毒的致病机制尚不明确，尤其是其细胞表面受体不确定，这成为研发抗埃博拉病毒疫苗和药物的瓶颈，严重影响了疫情控制。本课题组前期基于“基因密码子扩展技术”将具有叠氮基团的把手氨基酸高效、位点特异性地标记在VSV活病毒表面并据此建立了单病毒颗粒荧光示踪方法；还将含有光交联基团的非天然氨基酸插入到慢病毒载体的多个位点，通过光交联，找到多个参与病毒生命过程的蛋白质分子。本项目将借助单病毒颗粒荧光示踪方法深入研究埃博拉病毒与细胞识别、进入细胞、胞内运输等病毒感染过程，以期揭示其致病机制；同时通过在病毒包膜蛋白上插入光交联氨基酸，借助光交联技术发现埃博拉病毒的潜在受体，为埃博拉病毒疫苗和药物靶点的研发提供理论与实验支持。

埃博拉病毒（Ebola virus）是一种能引起人类和其他灵长类动物产生埃博拉出血热（EBHF）的烈性传染病病毒。EBHF是当今世界上最致命的病毒性出血热，感染者的死亡率可高达90%。但是由于这类病毒高度危险性，对其生物学特征、致病机理、疫苗研制、药物开发等方面的研究受到了限制。我们在前期工作的基础上，首先构建了只能单轮感染不能复制的“可视化的”埃博拉假病毒模型；利用“基因密码子扩展技术”将具有叠氮基团的非天然氨基酸高效、位点特异性地标记在埃博拉病毒囊膜蛋白上，通过叠氮与环辛炔的无铜点击化学反应，在活病毒表面定点偶联荧光分子，避免了以往研究中由于对病毒衣壳大幅度或非特异修饰，而造成的病毒包装效率低、活性差，实现了单病毒颗粒荧光示踪。在埃博拉假病毒模型上筛选到小分子化合物可以抑制病毒与细胞的膜融合，为了找到其作用靶点阐明作用机制，我们设计并合成了双功能小分子探针，通过光交联和click反应发现了埃博拉病毒的囊膜蛋白GP为化合物的作用靶点；并进一步通过蛋白质谱分析，发现GP2上的HR2为小分子探针共价交联的肽段，通过SPR、丙氨酸突变、分子对接等手段，证明五环三萜通过靶向HR2，抑制HR2与HR1的结合，进而抑制病毒与细胞的膜融合抑制病毒进入细胞，进一步提示HR2是潜在的抗埃博拉病毒药物作用靶点。以上研究为揭示埃博拉病毒致病机制、发现新的抗病毒药物作用靶点、研发病毒疫苗奠定了基础。