枸杞雄性不育相关蛋白基因的克隆及功能研究

植物雄性不育性在农作物杂种优势利用中起着重要作用，揭示雄性不育性发生的机理具有重要的理论和实践意义。蛋白质组学技术是一门新兴的先进的功能基因组学研究方法。枸杞雄性不育材料是新发现的，为我国特有、国际上没有的特异资源，与其有关的蛋白质组学研究尚未见到相关报道。本研究拟应用双向凝胶电泳、质谱分析和蛋白质鉴定等蛋白质组学研究技术，开展枸杞雄性不育材料YX-1和可育材料宁杞1号的小孢子败育前后关键时期花药的差异蛋白质组学研究，寻找与枸杞雄性不育性育性转换相关的差异表达蛋白，并进行N端氨基酸测序，以此合成简并引物，以mRNA反转录的cDNA为模板，应用RACE方法扩增差异蛋白相关基因的cDNA全长,并对差异蛋白基因的cDNA进行测序及序列分析，构建差异蛋白基因反义表达载体导入烟草，鉴定差异蛋白基因的功能。以获得与枸杞雄性不育性育性转换相关的基因，为探索枸杞雄性不育机理提供思路。

本项目以发掘调控枸杞花药发育相关的基因为目的，对枸杞雄性不育株和野生型不同发育阶段花药POD、EST、CAT、SOD、AMY和ATPase和游离脯氨酸含量进行了分析；开展了枸杞四分体早期花药差异蛋白组研究；克隆了14-3-3蛋白和查尔酮合成酶基因的cDNA全长；采用qRT-PCR方法分析了这2个基因在两种材料中的组织表达情况；gateway技术构建了基因的反义表达载体并通过农杆菌介导法转化烟草以验证2个基因的功能。结果表明，①雄性不育株和可育株POD、EST、SOD、AMY、CAT和ATPase的酶谱及活性，可溶性蛋白的SDS-PAGE谱带特征以及游离脯氨酸的含量均存在差异，表明这6种同工酶活性及游离脯氨酸含量可能与雄性不育相关。②在分离的1760多个蛋白点中，差异表达量1.5倍（p<0.05）以上的有52个，其中的12个在不育材料中上调表达，40个下调表达。经MALDI-TOF/TOF-MS/MS分析，有45个蛋白点被鉴定为40个不同的蛋白质。这些差异表达蛋白分别参与蛋白质合成和折叠（20％）、糖和能量代谢（18％）、信号转导（9％）、逆境响应（9％）、氨基酸代谢（7％）、花药发育（4％）、转录调控（3％）、脂肪酸代谢（2％）、核酸代谢（2％）、类黄酮合成相关（2%）和功能未知（7%）等，表明枸杞花药的发育是受一个复杂的网络调控的，多条代谢途径中多个蛋白的差异表达影响了花粉的育性。③克隆到枸杞花药Lb14-3-3的cDNA序列，长1005 bp，ORF长768 bp，编码256个氨基酸。Lb14-3-3基因在花药、果实和花中优势表达，而在根、茎、叶中的表达量很低；在四分体早期花药中，雄性不育突变体Lb14-3-3基因转录水平低于野生型，推测Lb14-3-3在花药发育过程中具有调控功能。④克隆了枸杞花药LbCHS基因的cDNA序列，长1448 bp，ORF长1167 bp，编码389个氨基酸。LbCHS基因在花药和花中优势表达，果实中的表达量很低，根、茎、叶中检测不到；在四分体早期花药中，雄性不育突变体中LbCHS基因转录水平下降；烟草转基因研究发现LbCHS异位表达引起花瓣白色和花丝短化的雄蕊，由于花丝缩短雄蕊无法触及雌蕊，不能正常授粉结实，通过人工授粉获得了转基因植株的后代。表明LbCHS在花瓣颜色和和雄性器官发育方面发挥了重要的调控作用。