枸杞雄性不育胼胝质酶基因的克隆与功能鉴定

植物雄性不育在农作物和蔬菜杂种优势利用中发挥着重要作用，对于提高粮食产量和品质改良具有重要意义。枸杞雄不育（YX-1）是所报道的世界第一例四分体解体出现问题的不育类型，具有杂种果粒大、品质佳、成熟早以及长势旺等优良特性。研究枸杞雄不育机理对于解决目前枸杞生产中存在的品种更新慢、产量低、品质单一的问题具有重要的现实意义。本研究根据枸杞雄不育胼胝质壁不能正确分解的细胞学特征，采用DNS法测定花药胼胝质酶的活性，水溶性苯胺蓝荧光染色法观察胼胝质的动态变化，利用RT-PCR、Tail-PCR以及3'RACE技术克隆枸杞的胼胝质酶基因，构建高效表达载体，然后转入大肠杆菌IPTG诱导表达，Ni亲和层析柱纯化目的蛋白，利用分离的花药四分体在离体条件下鉴定蛋白质活性。通过比较基因表达与酶活性的关系、酶活性与胼胝质壁分解的关系以及蛋白的酶学功能揭示胼胝质酶基因在枸杞雄不育中的作用机理。

植物雄性不育在农作物和蔬菜杂种优势利用中发挥着重要作用，对于提高粮食产量和品质改良具有重要意义。枸杞雄不育’宁杞5号’(YX-1)是所报道的世界第一例四分体解体出现问题的不育类型，具有杂种果粒大、品质佳、成熟早以及长势旺等优良特性。研究枸杞雄不育机理对于解决目前枸杞生产中存在的品种更新慢、产量低、品质单一的问题具有重要的现实意义。本研究以雄性不育枸杞（Lycium barbrarum ）‘宁杞5号’和正常可育枸杞‘宁杞1号’为材料，提取不同发育时期枸杞花蕾RNA，反转录合成cDNA，利用胼胝质酶的β-1,3-葡聚糖酶属性进行同源克隆和半定量RT-PCR分析。结果表明，所克隆的胼胝质酶基因（LG1）属于植物糖基水解酶第17家族基因，编码344个氨基酸，有5个氨基酸保守区在4种植物的花药β-1,3-葡聚糖酶基因中都存在；LG1在正常可育枸杞花药中高量表达，在雄性不育枸杞花药中表达沉默，但基因序列并没有发生突变；经苯胺蓝染色观察，雄性不育枸杞花药四分体分解受阻与LG1基因表达沉默同步。为了进一步鉴定LG1基因的酶学功能，本研究对编码LG1基因蛋白的密码子进行了人工优化和化学合成，构建高效表达载体pET30-LG1，然后转入大肠杆菌Rosetta (DE3)，1.0mM/L IPTG在37℃温度培养条件下诱导5h表达l量最大，总蛋白提取后使用Ni-NTA柱亲和层析纯化His-融合蛋白，采用DNS法和砷钼酸法两种方法对其蛋白活性进行了测定，但未能成功测定出其分解昆布多糖的β-1,3-葡聚糖酶学活性。枸杞胼胝质酶基因LG1蛋白的酶学性质、功能以及酶促反应的条件还需要进一步的深入研究。