西瓜雄性不育相关基因克隆及其功能的研究

从美国西瓜品系Sugarlee系统选育的雄性不育两用系Se18属于ms类型，其不育性为一对隐性细胞核基因控制。我们曾对其生物学特性和遗传特征进行了系统研究，利用分子标记技术对该性状相关基因进行了标记，并应用mRNA差异显示技术寻找和筛选了与西瓜核雄性不育相关的cDNA片段10个，进行了BLASter分析。本研究将利用直接PCR法和cDNA末端快速扩增的新型RACE技术克隆这些cDNA的全长序列，构建反义基因和正义基因表达载体，通过农杆菌的介导转西瓜的可育株和不育株，对转化植株进一步观察，分析目的基因的表达水平和部位以及其他功能，为进一步研究试图通过基因工程途径获得全不育的西瓜雄性不育系，为简化一代杂种生产中去雄等繁杂工序，提高制种效率创造材料，也为西瓜雄性不育基因工程的研究和应用提供理论和实践基础，同时也为其他作物所借鉴。

本研究以美国西瓜品系Sugarlee系统选育的雄性不育两用系Se18花蕾为试材，利用分子标记技术对该性状相关基因进行了标记，并应用mRNA差异显示技术寻找和筛选了与西瓜核雄性不育相关的cDNA片段10个，进行了BLASter分析并从中选择了1个与拟南芥雄性减数分裂MMD1所编码的PHD蛋白有很高同源性的重点基因片断进行研究，研究结果如下：.（1）通过系统的梯度实验，建立了西瓜核雄性不育相关基因DDRT-PCR体系。筛选了DDRT-PCR体系中各种反应因素的浓度，优化25μL体系中各组分浓度，该反应体系的产物经测序胶电泳和银染，可以获得数量适宜、带型清晰、重复性好的cDNA片段。 .（2）对于选定的PHD基因片断，通过5’RACE和3’RACE方法获得目的基因片断的全长双链cDNA，基因全长序列为1431bp，开放阅读框由759个碱基组成，编码了252个氨基酸，对所得序列结果比较分析，进行功能预测, 表明其蛋白具有较高的亲水性，其主要蛋白成分为谷氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、甘氨酸。并发现其与拟南芥雄性减数分裂MMD1所编码的PHD蛋白也有很高的同源性。.（3）将获得的PHD基因与含有35S启动子的pBI121载体重组，构建表达载体，利用农杆菌介导的叶盘法转入烟草中，通过5‰的卡那霉素筛选，获得了转基因植株。用PCR方法对带卡那抗性的转基因烟草植株进一步检测，结果证明目的基因已经整合到部分转基因苗的基因组中，成功地获得了转基因植株。.（4）建立了西瓜子叶高效再生体系并完善并建立了西瓜遗传转化体系，并通过农杆菌将目的基因转入西瓜子叶，获得部分西瓜T0代转基因植株，并对所得到的T0西瓜植株通过PCR验证，初步得出目的基因已经成功的转入西瓜中，并且得7 株T0西瓜转基因苗。