LbMYB1基因在宁夏枸杞花药发育中的调控机理研究

MYB transcription factor is a class of genes regulating response of plant hormones and environmental factors, cell differentiation, cell cycle regulation and secondary metabolism，and anthocyanin formation process, peel and flesh colored, as well as leaves and other organs morphogenesisimportant。 LbMYB1， a gene belongs to MYB class, was cloned from Lycium barbarum L.On this basis, we intend to study LbMYB1 in-depth, which include analysis of LbMYB1transcriptional activation by yeast system, temoral and spatial expression characteristics of LbMYB1 in anthers at different developmental stages by in situ hybridization. By methods of gene overexpression or RNA interference, and phenotypic and cytological analysis the transgenic plants of wolfberry, we will understand the biological functions of LbMYB1, and further use of transcriptomic and proteomic techniques, we will compare gene and protein expression differences between transgenic plants and non-transformed plants in anther development process, which clarifies regulatory mechanism and network of MYB transcription factor in anther development in Lycium barbarum and to provide a theoretical basis for the improvement of the wolfberry quality.

MYB类转录因子是近年来发现的一类调节植物激素和环境因子应答反应、细胞分化与细胞周期调控，次生代谢与花色素形成过程、果皮与果肉的着色、以及叶片等器官的形态建成的重要基因。本项目的前期工作已从宁夏枸杞中克隆了1个MYB类基因LbMYB1。在此基础上，本研究拟对花药发育相关的基因LbMYB1进行深入研究。主要包括：通过酵母系统分析LbMYB1基因的转录激活活性；通过原位杂交分析LbMYB1基因在花药不同发育阶段的时空表达特征；通过基因过量表达或RNA干涉获得转基因枸杞植株，进而通过表型鉴定和细胞学分析等手段了解LbMYB1基因的生物学功能；并进一步利用转录组和蛋白质组技术，比较转基因植株与非转化植株在花药发育过程中的基因和蛋白表达的差异，从而阐明MYB类转录因子在宁夏枸杞花药发育过程中的调控机制及网络，为枸杞品质的遗传改良提供理论依据。

MYB类转录因子是近年来发现的一类调节植物激素和环境因子应答反应、细胞分化与细胞周期调控，次生代谢与花色素形成过程、果皮与果肉的着色、以及叶片等器官的形态建成的重要基因。本项目的前期工作已从宁夏枸杞中克隆了1个MYB类基因LbMYB1。在此基础上，本研究拟对花药发育相关的基因LbMYB1进行深入研究。通过酵母系统分析LbMYB1基因的转录激活活性；通过原位杂交及qRT-PCR分析LbMYB1基因在花药不同发育阶段的时空表达特征；通过基因过表达或RNA干涉研究LbMYB1基因的功能，通过对转基因植株的表型鉴定和细胞学分析等手段了解LbMYB1基因的生物学功能；并进一步利用转录组技术，分析了枸杞花药发育过程中的基因表达差异。以期为阐明MYB类转录因子在宁夏枸杞花药发育过程中的调控机制及枸杞品质的遗传改良提供理论依据。研究结果主要包括以下几个方面：.（1）构建了Lb MYB1基因与绿色荧光蛋白融合表达载体，检测GFP 融合蛋白在洋葱表皮的瞬时表达表明，枸杞转录因子LbMYB1定位在细胞核。在大肠杆菌中诱导表达了LbMYB1蛋白。.（2）利用酵母单杂交实验，将LbMYB1与GAL4结合域融合后的pBD-LbMYB1，能够启动报告基因His3的表达，证明LbMYB1具有转录激活活性。.（3）qRT-PCR与原位杂交分析表明, LbMYB1基因在花药不同发育阶段都有表达，但是在四分体时期表达量高。 .（4）通过农杆菌介导法，将构建好的LbMYB1基因的过表达载体转入模式植物烟草和拟南芥，发现转基因植株花器官发育出现异常。 转基因烟草植株生长发育迟缓，开花率低于野生型，花瓣发育不完全，部分花瓣幼小畸变；花药出现褐化瘪小的现象。转基因拟南植株无花药或花药瘪小，花药开裂后无花粉释放；花发育时间异常，同一植株上部已有长角果，而植株下部花发育迟缓，果荚短小，无种子，呈现不育。.（5）通过农杆菌介导法，构建了LbMYB1基因的RNAi载体，并转化枸杞，获得了12株阳性苗，转化植株发育迟缓，植株矮小。.（6）枸杞不同发育时期花药转录组分析发现，与花药发育相关的差异表达的672个基因中，45个差异表达的基因处于LbMYB1调控网络中，其表达量在四分体时期显著升高。据此推测这45个基因受转录因子LbMYB1的调控，共同参与植物花药的发育过程。