宁夏枸杞果皮细胞壁差异蛋白表达及糖蛋白相关基因克隆

Lycium barbarum polysaccharide is the main effective component, belonging to a kind of the arabinogalactan-protein (AGPs). The function of AGPs was promoting root epidermal cells extension and the pollen tube elongation. In the same way, there was a highly consistent with existing between the fruit volume rapidly expanding and the rapid accumulation of glycoprotein located in cell wall after the turning color period, which suggested that there may be a special relationship between the accumulation of fruit glycoprotein and cell wall stretching and cell volume increasing. Therefore, this study intends to using the method of plant physiological and biochemical, proteomics and molecular biology, with green period, turning color period and mature period peel as material, systematicly research on the physiological metabolic changes of cell wall components, high flux differences in proteomics of cell wall, key genes cloning and expressing of differential expression proteins related to the accumulation of glycoprotein and excessive expression vectors constructing, genetic transformation and functional verification of differential expression protein gene of the Lycium barbarum L. pericarp during ripening. Through the above research, We can clear the key enzyme of glycoprotein synthesis and clone its gene，so as to ultimately reveal the molecular mechanism of accumulation of glycoprotein. The results have important theoretical and practical guiding significance to further clarifing not only the biological significance of the glycoprotein accumulation in fruit but also forming of medicinal materials quality of Lycium barbarum L..

枸杞多糖是中药枸杞子的主要有效成分，属于阿拉伯半乳聚糖糖蛋白(AGPs)的一种。阿拉伯半乳聚糖糖蛋白具有促进根尖表皮细胞扩展和花粉管伸长的功能。枸杞果实转色期后果实体积迅速膨大与糖蛋白在细胞壁的迅速积累在时间上具有高度的吻合性，暗示果实糖蛋白的积累与果皮细胞壁的极度伸展和细胞体积的增大可能存在着一种密切的关系。因此，本项目拟采用植物生理生化、蛋白质组学和分子生物学方法，以青果期、转色期和成熟期枸杞果皮为材料，系统研究果实成熟过程中果皮细胞壁组分的生理代谢变化、果皮细胞壁高通量差异蛋白质组学研究、与糖蛋白积累相关的差异蛋白关键基因克隆与表达和差异蛋白基因的超量表达载体构建、遗传转化和功能验证研究，明确调控糖蛋白合成的关键酶,克隆其基因,并进行功能验证，揭示糖蛋白积累的分子机制，研究结果对进一步阐明糖蛋白在枸杞果实中积累的生物学意义及枸杞药材品质的形成具有重要的理论和实践指导意义。

枸杞多糖是中药枸杞子的主要有效成分，属于阿拉伯半乳聚糖糖蛋白(AGPs)的一种，其具有促进根尖表皮细胞扩展和花粉管伸长的功能。为了验证枸杞果实糖蛋白的积累与果实发育的关系，项目采用植物生理生化、蛋白质组学和分子生物学方法，系统研究果实成熟过程中果皮细胞壁组分的生理代谢变化、高通量差异蛋白质组学、与糖蛋白积累相关的差异蛋白关键基因克隆与表达和差异蛋白基因的超量表达载体构建、遗传转化和功能验证研究，结果表表明：（1）枸杞果实细胞壁组分中的细胞壁物质、纤维素、ISP含量和代谢酶中的β-Gal、纤维素酶、PME活性变化与果实体积变化显著相关，且与枸杞多糖含量变化也存在显著相关，说明枸杞果实生长与细胞壁代谢及多糖积累存在密切关系。（2）采用蛋白质组学技术，分别对青果期、转色期和红果期枸杞果实蛋白质进行鉴定，共得到4054种蛋白，其中有824种差异表达蛋白。通过蛋白质组数据挖掘和文献阅读，研究筛选了可能与枸杞果实细胞壁代谢及AGP积累和调控相关的50个差异蛋白，随机挑选了16个差异蛋白进行PRM验证，最终推测确定与枸杞AGPs积累代谢相关的关键蛋白4种：FLA、β-Gal、RhaT、APX。（3）在完成4种差异蛋白的生物信息学分析的基础上，利用Uniprot数据库得到的4种差异蛋白的氨基酸序列和枸杞基因组数据，获得编码四种差异蛋白的cDNA序列，并以青果期果实为材料，进行4种差异蛋白的基因克隆和qRT-PCR验证，发现枸杞果实发育过程中FLA13和β-Gal在基因水平与蛋白水平的变化联系紧密。（4）采用Golden gate技术和全基因合成的方法，以pBWA(V)HS为载体，构建了FLA、β-Gal、RhaT、APX 4个基因的植物过表达载体，其中FLA、APX和RhaT成功转化烟草并获得阳性转基因株系，并对获得的T1代种子进行功能验证，发现Yariv试剂可以显著抑制烟草根系的伸长生长，且获得的3种转基因株系中，FLA 和RhaT的根系相对生长率明显高于对照，说明超量表达的FLA 和RhaT基因具有促进细胞伸长的功能。研究结果对进一步阐明糖蛋白在枸杞果实中积累的生物学意义及枸杞药材品质的形成具有重要的理论和实践指导意义。