枸杞14-3-3蛋白在花药发育中的功能及其参与BR信号调控网络解析

14-3-3 proteins are a family of wide, abundant, and highly conserved,regulatory protein in eukaryotic.14-3-3 proteins can identify the specific phosphorylation sequence to interact with target proteins.They play important roles in the cell by regulating the activity of the target protein, location and other characteristics involved in various aspects of signal transduction and regulation of plant growth and development, hormone signaling response and stress response.Lb14-3-3a，a gene belongs to 14-3-3 class, was cloned from Lycium barbarum .L. On this basis,we intend to further separate 3 to 4 wolfberry anther 14-3-3 gene and study them in-depth,which include analysis of temoral and spatial expression characteristics of 14-3-3 genes in anthers at different developmental stages by in situ hybridization. Use method of construction wolfberry anther yeast two-hybrid cDNA library, interaction proteins of wolfberry 14-3-3 proteins will be screened, and by methods of gene overexpression or RNA interference, and phenotypic and cytological analysis the transgenic plants of wolfberry, we will understand the biological functions of 14-3-3 protein, and further use of transcriptomic techniques, we will compare gene expression differences between transgenic plants and non-transformed plants in anther development process, and discover influnces by BR ,which clarifies regulatory mechanism and network of 14-3-3 in hormone signaling response of anther development in Lycium barbarum and to provide a theoretical basis for the improvement of the wolfberry quality.

14-3-3蛋白是一类广泛存在于真核生物中高度保守的调控蛋白家族，在细胞中通过调节靶蛋白的活性、定位等特性参与调控植物的生长发育、激素信号应答和胁迫应答等多个过程。本项目在前期枸杞花药差异蛋白质组研究中,发现了一个差异表达14-3-3蛋白,并已克隆了一个14-3-3a基因。在此基础上,本研究拟再分离3～4个枸杞花药14-3-3基因并进行深入研究,主要包括:基因的时空表达特征分析，通过构建枸杞花药酵母双杂交cDNA文库，筛选枸杞14-3-3蛋白的互作蛋白；通过基因过量表达或RNA干涉获得转基因枸杞植株，进而通过表型鉴定和细胞学分析等手段了解14-3-3蛋白的生物学功能；并进一步利用转录组技术，比较转基因植株与非转化植株在花药发育过程中的基因表达的差异,分析BR对枸杞花药发育的影响,揭示14-3-3蛋白在枸杞花药发育BR激素信号应答过程中的调控机制及网络,为枸杞品质的遗传改良提供理论依据。

14-3-3蛋白是一类广泛存在于真核生物中高度保守的调控蛋白家族，在细胞中通过调节靶蛋白的活性、定位等特性参与调控植物的生长发育、激素信号应答和胁迫应答等多个过程。前期枸杞花药差异蛋白质组研究中，发现了一个差异表达14-3-3蛋白，并已克隆了一个Lb14-3-3a基因。在此基础上，本项目分离了枸杞14-3-3蛋白家族Lb14-3-3b、Lb14-3-3c、Lb14-3-3d和Lb14-3-3e 等4个基因。采用qRT-PCR分析14-3-3蛋白家族基因在花药不同发育阶段的时空表达特征；通过基因过表达或RNA干涉研究枸杞14-3-3蛋白基因的功能，对转基因植株的表型鉴定和生理指标分析，了解枸杞14-3-3蛋白基因在植物花器官发育过程中的生物学功能。酵母双杂交系统筛选枸杞14-3-3蛋白的互作蛋白，并分析BR对枸杞花药发育的影响，揭示14-3-3蛋白在枸杞花药发育BR激素信号应答过程中的调控机制及网络，为枸杞品质的遗传改良提供理论依据。研究结果主要包括以下几个方面：.（1）克隆枸杞14-3-3蛋白家族的4个基因Lb14-3-3b、Lb14-3-3c、Lb14-3-3d和Lb14-3-3e。.（2）构建Lb14-3-3基因与绿色荧光蛋白融合表达载体，检测GFP 融合蛋白在洋葱表皮的瞬时表达，将枸杞14-3-3蛋白定位在细胞核。.（3）qRT-PCR分析表明, 枸杞14-3-3蛋白家族基因在花药不同发育阶段都有表达，但是在二核花粉粒时期表达量最高。.（4）农杆菌介导法转化Lb14-3-3基因到烟草，转基因烟草发育迟缓，植株矮小，花器官发育异常，花型畸变，缺少一片花瓣致使整个花型呈四角形，缺少一个雄蕊且花丝发育异常。.（5）农杆菌介导法转化马铃薯表明，结薯期和成熟期的转基因植株淀粉含量均高于野生型。.（6）通过酵母双杂交系统筛选到38个枸杞14-3-3蛋白的互作蛋白，点对点验证感兴趣的ATP合成酶、组氨酸蛋白激酶、转录调控蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等蛋白。.（7）用油菜素内酯（BL）处理后的花药Lb14-3-3基因的表达量与花粉萌发率均高于对照。.结论：枸杞Lb14-3-3蛋白家族基因可能通过调控淀粉代谢，以提供花药发育过程的能量需求而参与调控花器官和花药的发育，其调控过程受BR信号通路的影响。