新型半日花烷型二萜类化合物抗类风湿性关节炎的作用机制和构效关系研究

Rheumatoid arthritis (RA) has made a serious threat to human health. However, there is no effective therapy for RA up to now. Thus, the selective inducible nitric oxide synthase inhibitor (iNOS) is a new strategy for anti-RA drug development. In the previous work, we found seco-labdane diterpenoids remarkably inhibit the production of NO in the lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 macrophage cells for the first time. Preliminary mechanism studies have shown that seco-labdane diterpenoids exert therapeutic effect by down-regulation of the expression of iNOS. Based on the previous work, more seco-labdane diterpenoids are going to be isolated and elucidated from Callicarpa longissima. In vitro and in vivo models are established to estimate the NO inhibitory rate and anti-inflammatory activity of monomeric compounds. In addition, the mechanism of selective inhibition on iNOS expression and structure-activity relationship of seco-labdane diterpenoids will be further studied and provide a scientific basis for the development of anti-RA drugs.

类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）严重危害着患者的健康，但目前仍没有特效治疗药物，选择性诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抑制剂成为当前抗RA药物研发的新方向。前期研究发现来源于紫珠属植物的新型裂环半日花烷型二萜类化合物对NO生成有显著抑制作用；初步的作用机制研究表明裂环半日花烷型二萜类化合物通过选择性抑制iNOS表达而发挥抗RA作用。本项目拟继续对紫珠属植物中裂环半日花烷型二萜类化合物进行分离鉴定，采用炎症细胞模型及佐剂性关节炎大鼠模型评价单体化合物抑制NO生成及抗炎活性；同时采用Western blot等多种分子生物学方法探讨该类活性化合物选择性抑制iNOS表达的作用机制；采用分子对接法等研究活性化合物与靶蛋白的结合位点及构效关系，为寻找和发现新型抗类风湿性关节炎药物提供科学依据。

本项目在前期工作基础上，对紫珠属植物裸花紫珠和尖尾枫的抗类风湿性关节炎活性成分进行了研究。共分离和鉴定了66个二萜类化合物，其中40个裂环半日花烷型二萜类化合物。药理学研究方面，首先测试了裂环半日花烷型二萜类化合物对NO的抑制活性，发现39个化合物对NO均有抑制作用且无细胞毒活性。采用流式细胞技术检测了上述39个活性化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞凋亡的影响，结果表明0.4μM新化合物CN 26可以明显减少LPS诱导的RAW264.7细胞凋亡。采用Western blot 方法考察了分离得到的化合物对LPS诱导的RAW264.7 细胞中炎症相关蛋白表达的影响，结果显示，化合物CN 3、CN 5、CN 10、CN 12、CN 23可抑制NF-κB，iNOS的表达，化合物CN 6、CN 8、CN 15、CN 20可抑制IL-1β，IL-6的表达。体内实验表明，化合物CN 23高（200 mg /kg）、中剂量组均（100 mg /kg）可使类风湿性关节炎模型（RA）大鼠足趾肿胀程度显著下降，足趾容积增长速度恢复正常水平。此外，采用Western blot方法检测大鼠骨关节中NF-κB，iNOS，p-IKKα/β蛋白的表达情况，结果表明，化合物CN 23对佐剂诱导型RA (Adjuvant-induced Arthritis，AA) 模型大鼠关节中NF-κB，iNOS， p-IKKα/β蛋白的表达均有一定的抑制作用。目前，我们正在利用分子对接技术研究化合物CN1~CN10与iNOS蛋白相结合的作用位点，同时对化合物CN 23进行结构修饰（引入甲基），期望得到活性更强的化合物。