拟南芥中CDPK相关蛋白激酶参与调控ABA信号的分子机制研究

CDPK-related protein kinases(CRKs) with calcium/calmodulin-dependent activity, are the important protein kinases in plant calcium/calmodulin signal system, but the function of CRKs had been reported rarely. We have found that CRK5 and its interacted protein DWA4 (DWD domain protein hypersensitive to ABA 4)in Arabidopsis might be invovled in the ABA-regulated seed germination. Based on this experimental result,in this project, the interaction between CRK5 and DWA4 will be further confirmed using bimolecular fluorescence complementation and Co-IP, in vitro kinase activity analysis method will be used to explore whether DWA4 as the substrate of CRK5 protein kinase or DWA4 regulating the kinase activity of CRK5, and at the same time, we will explore the funnction of phosphorylation and the interaction between CRK5 and DWA4 in ABA-regulted seed germination using genetic and molecular methods. It has been reported that DWD domain protein interact with DDB1 and E3 ubiquitin system, we plan to study whether CRK5 and DWA4 regulate seed germination also through the degradation of ABI5 by ubiquitin-proteasome system. Finally, the regualting mechanism between CRK5 and ABA/PYR/PP2C will be explored. This project will provide powerful and experimental proof in understanding the relationship among calicium system, E3 ubiquitin proteasome and ABA signal transduction sysrem.

CDPK相关蛋白激酶（CRKs）是植物钙信号系统中重要的蛋白激酶，其激酶活性依赖于钙和钙调素，在生化性质上不同于CDPKs，但有关CRKs在植物中的功能研究鲜见报道。我们前期的研究发现拟南芥CRK5和其相互作用蛋白DWA4(DWD domain protein )可能参与了ABA调节的种子萌发过程。在此基础上，本立项拟利用荧光互补和Co-IP方法进一步验证二者的相互作用，并利用体外磷酸化实验分析DWA4是否为CRK5激酶作用底物以及DWA4是否调节CRK5活性，结合遗传学和分子生物学方法分析磷酸化作用以及二者的互作是否影响ABA调节的种子萌发。同时验证CRK5和DWA4是否通过泛素降解系统降解ABI5参与调控种子萌发。最后初步探索研究CRK5是否与ABA/PYR /PP2C受体系统存在调节机制。本立项的研究将为揭示钙信号系统、泛素连接酶系统与ABA信号转导之间的调控机制提供有力的理论依据。

在植物体内，ABA信号的转导和完成与钙信号系统中的蛋白激酶存在着网络调控的关系，尤其是CDPK-SnRK蛋白激酶家族在其中发挥着重要的作用。酵母双杂交实验筛选和验证得到39个与CRK5相互作用的蛋白，其中一个具有DWD结构域的相互作用蛋白的T-DNA插入突变体种子在萌发时表现出对ABA超敏感，该蛋白命名为DWA4，即DWD domain protein hypersensitive to ABA 4。DWA蛋白已经被证明是CUL4-E3泛素连接酶系统中的底物“adapter”，负责与ABI5相互作用，通过调节ABI5的泛素化降解参与ABA信号传递。Pull-down和BIFC实验进一步验证了CRK5和DWA4在细胞内的相互作用。同时，二者相互作用以后定位于细胞膜。基因枪实验结果表明，CRK5单独定位于细胞膜，而DWA4则定位于细胞膜和细胞核。体外泛素化实验结果表明，CRK5的泛素化依赖于DWA4的表达。CRK5被报道参与了根的向地性生长，但是我们的实验结果表明，虽然CRK5在细胞内降解受到抑制，但是细胞内过量的CRK5并不影响其参与根的向地性生长。上述研究成果已经在SCI杂志上发表。我们同时研究了CRK5与DWA4之间的磷酸化作用。体外磷酸化检测发现，DWA4可以被CRK5磷酸化；点突变结合体外磷酸化检测结果证明在DWA4上70位的丝氨酸是主要的磷酸化位点；抗体检测植物细胞内的DWA4，发现该蛋白在植物细胞内存在磷酸化状态；在crk5突变体中，DWA4的磷酸化状态发生了改变。上述结果暗示，CRK5参与了DWA4在细胞内的磷酸化作用。该部分的实验结果已经投稿。进一步研究了CRK5和DWA4参与ABA信号调控中的分子机制。研究发现，在dwa4突变体种子在培养基中施加ABA的情况下，在萌发过程中，ABI5的降解被抑制；同样CRK5过量表达植株的种子，在同样情况下也有ABI5降解受抑制的现象。体外磷酸化实验证明CRK5可以磷酸化ABI5；BIFC结果表明CRK5和ABI5相互作用，二者结合后定位的位置在膜以及细胞质中。