CAG调控的新型人畜共用布鲁菌DNA 疫苗的构建及其初步应用

布鲁菌是人兽共患布鲁菌病的病原菌，是一种胞内寄生菌，主要导致人波浪热和结缔组织疾病以及病畜流产。其致病性强，流行范围广，危害十分严重。本项目利用基因重组技术，将布鲁菌rplL分别与omp31、bcsp31基因（分别编码L7/L12，Omp31，Bcsp31蛋白）嵌合后分别克隆入真核表达载体pSCW中，利用CAG启动子和调节元件WPRE进行转录调控结构的优化，同时联合应用抗原加工分子基因（HSP70C、泛素），以在原有基础上进一步提高嵌合基因的表达水平并促进抗原的加工和递呈。另外，使用IL-12作为免疫佐剂，加强免疫效果。进一步对这些重组真核表达载体的免疫学特性进行系统比较研究，以期获得更好的疫苗免疫保护效果。从而研制出较现有减毒活疫苗更为安全、简便、有效的新型疫苗。本项目的实施和完成将为布鲁菌DNA疫苗的研究提供重要的理论和实践基础，对于预防人畜布鲁菌病均具有重要的意义。

布鲁菌病是一种世界范围的人畜共患病，可在人类，羊、牛、狗、猪等哺乳类动物以及沙林鼠等啮齿类中广泛传播。该病可导致牲畜流产和人波浪热。预防布鲁菌病的有效途径是对易感动物和人群进行疫苗接种。现有的布鲁菌疫苗分为灭活疫苗和减毒活疫苗存在一些问题：布鲁菌是一种胞内寄生菌，细胞免疫可清除细胞内布鲁菌，在抗布鲁菌感染免疫中占主导地位；而灭活疫苗引起的细胞免疫应答很低，保护力差；我国目前应用的减毒活疫苗包括羊M5、牛S19和猪S2，这些减毒活疫苗存在着毒力可能恢复而造成接种者感染的风险；另外，减毒活疫苗所产生的持续的血清学反应，导致无法区分人工免疫与自然感染。. 本项目将布鲁菌rplL与omp31/bcsp31基因（分别编码L7/L12，Omp31，Bcsp31蛋白）克隆入双表达框的穿梭载体pYr-ads-3中，利用CAG启动子优化同时联合应用抗原加工分子基因HSP70C，以在原有基础上进一步提高嵌合基因的表达水平并促进抗原的加工和递呈。将上述载体体外重组，克隆入腺病毒表达载体中，分别从DNA、RNA和蛋白水平对制备的腺病毒进行检测，结果表明构建正确。将上述腺病毒载体纯化后免疫小鼠，对其进行免疫学评价。结果所制备的腺病毒载体Ad-cag-rh-bcsp31h组和Ad-cag-rh-omp31h组抗体水平最高值均在末次免疫后9周出现，抗体滴度分别为1:5120和1:10240，均高于阳性对照M5组（p<0.05）；ELISpot 检测小鼠的脾细胞经特异性抗原刺激后能产生IFN-γ和IL-2的能力，结果表明各重组腺病毒组均大于M5疫苗组产生IFN-γ或IL-2的细胞数目（p<0.05）；流式细胞术检测免疫小鼠血液中CD4分子和CD8分子的含量，结果显示，腺病毒组CD8分子高于空载体组，也高于M5组；各重组腺病毒组CTL效应随着效靶比值的升高而增强，在效靶比100 : 1的时，杀伤效果最显著。各重组腺病毒组和M5组的杀伤效应均强于盐水组（p<0.001）。其效靶比在100 : 1和50 : 1时，重组腺病毒组诱导的杀伤效应均高于M5疫苗对照组（p<0.05），以Ad-cag-rh-omp31h组最佳。.在本项目的资助下我们已经发表SCI一篇，中文核心期刊两篇，申请专利一项，毕业研究生一名。本项目的完成为布鲁菌新型疫苗的研究提供重要的理论和实践基础，对于预防布鲁菌病具有重要的意义。