一种以Armored RNA作为报告基团的免疫-PCR检测方法的建立

In this study, MS2 VLPs containing conserved region of 16S rRNA gene of Ureaplasma urealyticum genome were expressed in E.coli prokaryotic expression system. MS2 VLPs were chemically crosslinked with HBsAb and anti-rabbit IgG antibodies respectively, and then an immuno-polymerase chain reaction method using Armored RNA as reporting group was established. The mature real-time fluorescent RNA isothermal amplification (TMA) technology was used to amplify MS2 VLPs. The rapid analysis of virus-like particle reporter molecule by chemical reagent kit can not only be used for the detection and analysis of trace hepatitis B surface antigen (HBsAg), but also be used as a general detection platform to realize the detection of a variety of trace and trace clinical diagnostic important markers, thus solving the problem of detection of trace protein markers that has been plagued by peers. Armored RNA as the reporting group has the advantage that it can make the reported nucleic acid molecule not be exposed to the reaction solution, and can tolerate the digestion of RNA and DNA enzymes. Because it has no biological infectivity, it provides a biological security guarantee for the mailing and preservation of reagents. At present, there is no report on the use of RNA as a reporter molecule in the related immuno-PCR detection technology at home and abroad.

本研究拟采用大肠杆菌原核表达包含解脲脲原体基因组16s rRNA基因保守区序列的MS2噬菌体病毒样颗粒（MS2 VLPs），将其分别与乙肝表面抗体（HBsAb）、抗兔IgG抗体进行化学交联，建立以Armored RNA为报告基团的免疫-PCR检测方法，利用已成熟的实时荧光RNA等温扩增技术（TMA）商品化试剂盒对病毒样颗粒报告分子进行快速分析，不仅可以用于微量乙肝表面抗原的检测分析，还可以作为一个通用的检测平台，实现对多种微量、痕量临床诊断重要标志物的检测，从而解决一直困扰检验同行的微量蛋白类标志物的检测难题。Armored RNA作为报告基团的优势在于可使报告核酸分子不必裸露于反应溶液中，且可耐受RNA酶和DNA酶的消化，由于其没有生物传染性，对试剂的邮寄、保存提供了生物安全的保证。目前，国内外还没有利用RNA作为报告分子的相关免疫-PCR检测技术的报道。

对特定抗原进行的以抗体为基础的免疫检测是各种分子和细胞学检测的基石。临床常规检测项目中，多数蛋白类物质是通过免疫学方法进行定性或定量检测，如酶联免疫吸附技术（ELISA）、化学发光免疫分析技术（CLIA）和电化学发光免疫分析技术（ECLI）。但一些感染性疾病、癌症以及慢性疾病中存在的许多重要标志物由于浓度较低，用传统的免疫学方法无法检出，从而影响了其广泛应用，如目前对HBsAg可检出的最低浓度为0.05 IU/ml。为解决这一难题，本研究采用大肠杆菌原核表达包含HCV 5’UTR区部分序列的MS2噬菌体病毒样颗粒（MS2 VLPs），将其分别与HBsAb、抗兔IgG抗体进行化学交联，利用已成熟的商品化试剂盒对病毒样颗粒报告分子进行快速分析，成功建立以HCV VLPs中的Armored RNA作为报告基团的免疫-PCR检测方法。该方法对HBsAg检测的线性范围为0.008-8000 IU/ml、检出限LOD为0.001 IU/ml、重复性良好且能够抵抗一定浓度的溶血、黄疸、脂血的干扰。利用该免疫-PCR方法对临床不同浓度的HBsAg样本检测结果显示，该方法灵敏度远高于CMIA法和ELISA法，比目前最优秀的ECLI法的灵敏度至少提高了50倍。对于低、中、高浓度样本，免疫-PCR法与上述方法的结果均显示出很好的一致性，对于极低浓度样本，在CMIA或ECLI法与HBV DNA的定性检测结果不一致时，免疫-PCR方法可以帮助识别是否为急性乙肝的检测窗口期或低水平HBsAg的慢性乙肝患者尤其是隐匿性乙肝患者的漏检，有十分重要的临床应用价值，实现了对临床样本HBsAg准确、敏感、特异的检测。该方法的建立将解决困扰众多乙肝患者（包括急性乙肝恢复期患者、慢性乙肝患者和乙肝隐匿期患者）因各种原因（包括所处临床不同病程时期、乙肝病毒相关基因突变等）所致的血清中乙肝表面抗原难以检测到，或由于含量极低造成的费时、费力、费钱的难题。本研究为以Armored RNA作为报告基团的免疫-PCR方法扩展作为通用检测平台提供了思路，有望实现对多种微量、痕量临床诊断重要标志物的检测。