甜叶菊糖苷rebaudiosides-C、rebaudiosides-F生物合成途径关键酶基因的克隆及功能研究

Steviol glycoside have intense sweetness and health function but non-caorific,that does not metabolize in the human body.which was seriously considered as a new natural sources of sucrose,With wide application prospect and high economic value.But，steviol glycoside have low Rebaudioside-A content in current market，that influenced sweetness and flavor of Steviol glycoside,the market boundary and Industrial purification of Rebaudioside-A.The research will use modern molecular biology methods,to clone UDP-rhamnosyltransferases and UDP-xylosyltransferases in Bitter glycoside rebaudiosides-C and rebaudiosides-F biosynthetic pathways，On the basis of Study gene function ，and reveal molecular mechanism of Steviol glycoside biosynthetic pathways,advance a new policy that use genetic engineering to improve rebaudiosides-A content，effort to radically resolve problem of low rebaudiosides A content，and industrial purification difficult.

甜叶菊糖苷因甜度高、低热能、不参与人体内代谢兼具保健功能等特点，被誉为最有发展前途的新糖源，具有广泛的应用前景和很高的经济价值。但目前市售甜叶菊糖苷因甜味成分RA（Rebaudioside A)含量较低，严重影响了甜叶菊糖苷的甜度和口感，以及甜叶菊糖苷的市场应用范围和工业上RA的提纯。本研究将利用现代分子生物学方法，克隆甜叶菊苦味糖苷RC和RF生物合成途径关键基因UDP-鼠李糖基化酶基因和UDP-木质糖基化酶基因，在研究这两个基因功能，揭示甜叶菊糖苷生化合成途径分子机理的基础上，提出利用基因工程技术对甜叶菊糖苷RA含量进行改良的策略，以期从根本上解决 RA含量低，工业提纯困难等问题。

甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）为菊科多年生草本植物，其叶片富含的糖苷因甜度高、热能低、不参与人体代谢兼具保健功能等特点，被誉为最有发展前途的新糖源，具有广泛的应用前景和很高的经济价值。但目前市售甜叶菊糖苷因含有苦味糖苷RC，严重影响了甜叶菊糖苷的甜度和品质。本项目通过转录组测序数据分析，从甜叶菊中克隆到了糖苷RC、RF生物合成途径UDP-鼠李糖基化SrRha和UDP-木糖基化酶SrXyl基因，SrRha基因CDS全长2022bp，编码673个氨基酸，亚细胞定位结果表明蛋白定位于细胞核。SrXyl基因CDS全长为1323bp，编码440个氨基酸，亚细胞定位结果表明蛋白定位于细胞质外。体外酶活性分析结果表明，SrRha可将鼠李糖基转移到甜茶糖苷C13位的葡萄糖基上，负责含有鼠李糖基的苦味糖苷DA、RC的合成；SrXyl可将木糖基转移到甜菊醇单糖苷C13位的葡萄糖基上，负责含有木糖基的RF的合成。在MS+30mg∙L-1Lsucrose+0.5mg∙L-1IAA+1.5mg∙L-1BAP+0.5mg∙L-1KT+7g∙L-1agar,7g∙L-1Kan,100g∙L-1Car的遗传转化条件下，利用转基因技术分析SrRha和SrXyl基因在甜叶菊中的功能作用，结果表明，SrRha在负责苦味糖苷RC合成的同时，更多的会影响到甜味糖苷RD和总糖苷的含量。本研究揭示了甜叶菊苦味糖苷RC的生物合成途径，进一步完善了甜叶菊糖苷生物合成的分子机理，为利用基因工程技术进行甜叶菊糖苷的品质改良奠定了理论基础