基于甜叶菊糖苷突变体的糖基转移酶（SrUGT)新基因挖掘及功能解析

Stevia rebaudiana Bertoni is known as the third sugar resources. Steviol glycosides (SGs) are the sweetening ingredients with higher sweetner and lower calorie. There are more than 20 different types known SGs. The biosynthesis of SGs are intitated from the first step of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway to form steviol firstly. All the key enzyme genes in this process are cloned and functionally determined. Subsequent glycosylation of steviol results in all sorts of SGs under the catalyzation of the different UDP-glycosyltransferases (UGTs). But until now，the research on SrUGTs of S. rebaudianum are focused on the SrUGT85C2, SrUGT74G1and SrUGT76G1. A great number of new SrUGT genes related to the biosynthesis of SGs remain unknown. The SCs mutants radiation-induced by leaf callus of S. rebaudianum will be utilizated to select the new SrUGT genes and their co-expression genes related the biosynthesis of SGs ( especially RD, etc.) by using full-length and RNA-Seq (namely 3+2 generation) transcriptome sequencing in this project. And the functions of these SrUGT new genes will be determined by the methods of eukaryotic expression, transgene and Agrobacterium mediated transient gene silencing (AMTS), in order to provide the solid foundation and scientific proof for improving the special SGs contents through artificial regulation.

甜叶菊被誉为“第三糖源”，其甜味成分糖苷具高甜度、低热量等特点。已知的甜菊糖苷有20余种，其生物合成是经2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径先形成甜菊醇，该过程的关键酶基因均已被克隆。甜菊醇在不同UDP-糖基转移酶(UGTs) 作用下可形成不同种类甜菊糖苷，迄今有关甜叶菊UGT基因的研究主要集中在SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1, 大量与甜菊糖苷生物合成有关的SrUGT新基因有待挖掘。本项目拟利用课题组前期经甜叶菊叶片愈伤组织辐射诱变得到的甜菊糖苷突变体，进行全长和RNA-Seq（即3+2代）转录组测序，试图筛选出与甜菊糖苷（尤其RD等优质糖苷）生物合成有关的SrUGT新基因及其共表达基因，并拟采用真核表达、转基因、基因沉默和酵母双杂交等技术对这些基因进行功能验证，旨在为进一步通过人工调控提高甜叶菊特定优质甜菊糖苷含量奠定坚实基础，提供科学理论依据。

甜叶菊被誉为“第三糖源”，其甜味成分糖苷具高甜度、低热量特点。甜菊糖苷的生物合成是经MEP途径形成甜菊醇，进而在不同糖基转移酶SrUGTs作用下形成不同种类甜菊糖苷，其中RA、RD和RM因甜度高、口感好被称作优质糖苷。本项目首次建立了甜叶菊叶片全长转录组数据库，完善了甜叶菊RNA-Seq转录组数据库。基于30859条高质量全长unigenes数据源，共获得98条非冗余全长SrUGTs，可被分类到21个UGT家族。基于WGCNA分析共获得31个具完整ORF框，与葡萄糖基糖苷合成相关的全长候选SrUGTs。经原核表达、蛋白纯化和酶催化反应发现，甜菊糖苷的葡萄糖基化主要由SrUGT85C2、SrUGT74G1、SrUGT76G1和SrUGT91D2参与完成，特别是后二者为参与催化合成RA、RD和RM苷的最主要糖基转移酶。上述四个糖基转移酶基因的表达量以及酶结构变化引起的催化效率的不同共同导致葡萄糖基糖苷种类和含量不同。其中SrUGT76G1和SrUGT85C2基因序列变异较大，SrUGT74G1和SrUGT91D2则相对保守。结合同源建模、分子对接分析、点突变和酶催化反应发现，SrUGT76G1疏水口袋残基是否有极性的变化，残基的差异是否导致活性口袋形状和大小改变，活性口袋是否能较好包裹糖基受体底物是该酶活关键，其酶活有无与强弱受蛋白整体结构影响更大，单个残基的改变不会显著提高其催化效率，但却可导致其活性丧失。SrUGT91D2基因对相关糖苷含量的影响则可能主要来自其表达量高低，T84、T144、R404、A194和G409是SrUGT91D2催化糖苷糖基化的关键残基。SrUGT85C2和SrUGT74G1的情况分别类似SrUGT76G1和SrUGT91D2。本研究还发现SrUGT-89A2是一个潜在催化莱鲍迪D苷合成的新糖基转移酶基因；SrUGT-741酶为可催化异槲皮苷形成三种葡糖苷化合物的新黄酮苷糖基转移酶基因；基因共表达分析和酵母单杂交试验表明，SrMYB1可与SrUGT76G1启动子结合，可能调控SrUGT76G1基因表达。外源喷施水杨酸可促进糖苷生物合成途径中多个关键酶基因表达量提高，甜菊糖苷总量提高，转录表达谱研究结果表明水杨酸可能进一步通过介导ABA途径来完成在甜叶菊中的信号转导。本研究还创制出高产、高RA型耐硼和喜锌突变体，在生产上有很好应用价值。