应用TALENs新技术敲除和敲入znf513基因建立与研究视网膜色素变性的模型与发病机制

Retinitis pigmentosa (RP), one of the most severe forms of inherited retinal dystrophy, can be transmitted usually as an autosomal dominant, recessive, or X-linked trait. We recently demonstrated that a c.1015T>C mutation in ZNF513 causes autosomal recessive retinitis pigmentosa in a consanguineous Pakistani family. Here we propose using artificial transcription activator-like effector nucleases (TALENs), a powerful new approach for zebrafish genome editing, to develop a znf513 gene knockout model. Initially, we will evaluate eye development, photoreceptor morphology, and ERG results in a znf513 knockout zebrafish, and a targeted knock-in of the c.1015T>C variant in both alleles. We will then carry out immunocytochemistry to characterize the effects on the retina, especially the outer segment, compare gene expression between WT and c.1015T>C mutant ZNF513 fish and transfected cells, and test for znf513 siRNA-induced cell death in cultured cells to evaluate the mutant phenotype. We will also carry out in situ hybridization of different eye tissues to compare expression of ZNF513 in humans and zebrafish. These studies and the use of a vertebrate animal model are instrumental in understanding the molecular and developmental role of ZNF513 in the retina and in retinitis pigmentosa. Such information will be useful in designing gene and pharmacological therapy as possible interventions for RP in the near future.

遗传性视网膜色素变性(RP)是严重的致盲性眼病。目前尚缺乏有效的预防和治疗手段。2010年我们率先报道了一个严重的常染色体隐性RP家系，定位和克隆了致病基因ZNF513。本课题以znf513基因为突破口，利用实验室已建立的斑马鱼基因敲低技术平台，借助TALENs新技术，敲除RP致病基因znf513，构建移码突变导致的RP动物模型；在基因敲除基础上敲入含有点突变基因序列，研究错义突变导致RP的动物模型。观察斑马鱼表型、眼的发育、视网膜光感受器细胞结构和生物学改变，以及致病基因与其他已知RP致病基因的相互调控；同时在体外，利用细胞共定位、基因沉默、免疫染色等技术从细胞分子水平分析致病基因的表达和功能；分析总结实验动物和人类RP基因型和表型的关系。本课题对探索的发病机制有重要的科学意义，结果将为药物干预或者基因治疗奠定基础，同时为其他遗传性眼病的研究提供了新的发展方向。

遗传性视网膜色素变性(RP)是严重的致盲性眼病。目前尚缺乏有效的预防和治疗手段。2010 年我们率先报道了一个严重的常染色体隐性RP 家系，定位和克隆了致病基因ZNF513。本课题以znf513 基因为突破口，利用实验室已建立的斑马鱼基因敲低技术平台，借助TALENs 新技术，敲除RP 致病基因znf513，构建移码突变导致的RP 动物模型；在基因敲除基础上敲入含有点突变基因序列，研究错义突变导致RP 的动物模型。观察斑马鱼表型、眼的发育、视网膜光感受器细胞结构和生物学改变，以及致病基因与其他已知RP 致病基因的相互调控；同时在体外，利用细胞共定位、基因沉默、免疫染色等技术从细胞分子水平分析致病基因的表达和功能； 分析总结实验动物和人类RP 基因型和表型的关系。本课题对探索的发病机制有重要的科学意义，结果可为药物干预或者基因治疗奠定基础。