建立条件性敲除/敲入DPPA2基因小鼠模型应用于肝癌发生机制的研究

Cancer seriously endanger human life because of its high morbidity and high mortality. Defining the molecular mechanism of tumorigenesis and tumor progression has very important clinical significance and application value. Related studies have shown that pluripotency plays an important role in tumor cell self-renewal and tumorigenesis. Our early original discovery of the pluripotency factor DPPA2 is involved in the key pathological process from normal tissue to carcinogenesis. Further studies have found that inhibition of DPPA2 expression can significantly inhibit the proliferation of liver cancer cell lines. Based on these research findings, this study aims to construct a Rosa26 fixed-point knock-in mouse model which conditionally overexpresses DPPA2 gene by using CRISPR/Cas9 technology, and to construct a conditional knockout DPPA2 gene mouse model by ES targeting technique. With the help of mouse model, experiments in vitro and in vivo, high-throughput sequencing and bioinformatics analysis, we will reveal a new mechanism of DPPA2-mediated signaling pathway abnormality involved in tumorigenesis. It is very important to provide effective molecular targets and feasible treatment strategies for early clinical treatment, in order to achieve the etiological treatment and early prevention of tumors。

癌症危害人类健康，发病率高，死亡率高。明确肿瘤细胞发生与维持的分子机制，具有非常重要的临床意义和应用价值。相关研究表明，多能因子在肿瘤细胞自我更新和肿瘤发生中发挥着重要作用。我们前期原创性发现多能因子DPPA2参与了从正常组织到发生癌变这一关键的病理过程。进一步研究发现，抑制DPPA2表达可明显抑制肝癌细胞系增殖。本课题拟在此基础上，采用CRISPR/Cas9技术，构建条件性过表达DPPA2基因的Rosa26定点敲入小鼠模型；采用ES打靶技术，构建条件性敲除DPPA2基因小鼠模型，并以小鼠模型为主要研究材料，通过体内体外实验并结合高通量测序与生物信息学分析，揭示DPPA2介导的信号通路异常参与肿瘤发生的新机制。为临床早期治疗提供有效的分子靶点和可行的治疗策略，以期实现肿瘤的病因学治疗和早期预防，具有非常重要的意义。

发育多能因子DPPA2是早期胚胎发育和体细胞重编程为诱导多能干细胞的关键分子。其最初被命名为胚胎/癌症序列（ESCA），这是基于其在胚胎干细胞（ESC）中高水平表达及其在某些类型癌细胞中再激活的特性，但其对肿瘤尤其是肝癌发生发展的功能和作用机制尚未得到明确阐述。我们前期原创性发现DPPA2参与了肝脏从正常组织到癌变这一病理过程，申请人进一步通过细胞划痕实验、集落形成实验、流式分析等体外实验，并结合HBX转基因小鼠、DEN&CCL4化学诱导肝癌小鼠模型以及裸鼠皮下荷瘤模型等体内实验，初步证实DPPA2参与调控肝癌细胞的增殖和迁移。基于以上实验结果，负责人采用CRISPR/Cas9技术，成功构建了条件性过表达DPPA2基因的Rosa26定点敲入小鼠模型；采用ES打靶技术，成功构建了条件性敲除DPPA2基因小鼠模型，并以转基因小鼠模型为核心研究材料开展了相关研究。使用DEN&CCL4化学致癌物诱导不同组别模型小鼠发生肝癌，实验结果发现，相比DPPA2条件性敲除对照组，敲除组小鼠肝脏的肿瘤直径小，肿瘤个数显著少；相比DPPA2条件性敲入对照组，敲入组小鼠肝脏的肿瘤直径大，肿瘤个数显著多。为了深入探究DPPA2的作用机制，负责人依托课题组，对各组别小鼠的肝脏肿瘤组织进行了单细胞转录组测序，肝脏细胞分析结果显示DPPA2与谷胱甘肽转移酶家族基因、AFP、发挥抑癌作用的Xist等长链非编码RNA相关；巨噬细胞分析结果显示DPPA2敲除后特异性激活促炎作用的M1型亚群细胞，DPPA2敲入后特异性抑制部分亚群细胞发挥促炎作用。以上结果证实DPPA2确实在肝癌发生发展中起到了非常重要的作用，初步揭示了DPPA2发挥作用的分子机制。申请人将继续深挖单细胞测序结果，结合实验进一步确认DPPA2相关信号通路和关键分子在肝癌发生中的作用机制，以期为肝癌的临床早期诊断和治疗提供干预的分子靶点。