母源PRC1.1对小鼠植入前胚胎发育的表观遗传调控机制研究

Polycomb repressive complex1 (PRC1) plays critical roles in early embryonic development. However, due to diverse homologs of PRC1 core components, the biological functions and the regulatory mechanism of specific PRC1 subtype in early embryos remain to be elucidated. Previously, we applied single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) to the individual cells from different stages human preimplantation embryos. By analyzing the expression profile of PRC1 core components, we found that PCGF1, as a maternal factor, might compose a major maternal PRC1 subtype complex, accounting for the role of PRC1 in preimplantation embryos. In this project, we are going to use morpholinos to interfere maternal PCGF1 expression in mouse preimplantation embryos, and apply scRNA-seq, PBAT, STAR-ChIP-seq analysis to these embryos, to reveal its biological functions, downstream genes and epigenetic regulatory mechanism. We will also use CRISPR/CAS9, ChIP-seq and RRBS to further supplement the epigenetic regulatory mechanism of PCGF1/PRC1.1 in early embryos with mouse embryonic stem cells. Finally, we will use IP and gel filtration to purify PRC1.1 complex, and use mass spectrum, co-IP to identify its components. Together, these results will give us more insights into the epigenetic regulatory mechanism of maternal PRC1 in early embryos.

PRC1复合体在胚胎发育早期具有重要功能，然而，由于其成分复杂、存在多个亚型，目前对PRC1各亚型的具体功能及调控机制尚不清楚。我们前期通过单细胞RNA-seq分析人类植入前胚胎各时期细胞的基因表达水平，发现PCGF1作为母源因子，可能参与形成主要的母源PRC1亚型，即PRC1.1。在此基础上，本课题拟利用小鼠早期胚胎，通过基因沉默技术、单细胞RNA-seq、PBAT及STAR-ChIP-seq研究PCGF1／PRC1.1在早期胚胎中的功能、下游基因及其通过组蛋白修饰、DNA甲基化修饰调控的分子机制。进一步，利用胚胎干细胞模型深入揭示PCGF1／PRC1.1的表观遗传调控机制。最后，将通过蛋白免疫沉淀、凝胶过滤层析及蛋白质谱等相关技术鉴定母源PRC1.1组分。本课题的完成可为揭示母源PRC1调控早期胚胎发育的表观遗传学机制提供线索。

在哺乳动物植入前胚胎发育过程中，伴随着受精卵的数次卵裂，胚胎逐步恢复全能性，并发生了第一次细胞命运决定，产生了内细胞团（ICM）和滋养外胚层（TE）。临床中发现大量的人类胚胎阻滞在合子基因组激活（ZGA）及围着床时期，因此，阐明早期胚胎发育的调控机制具有重要的临床意义。PRC1复合体（Polycomb repressive complex1）在胚胎发育早期具有重要功能，根据PCGF家族蛋白可以将PRC1分为6种亚型。由于PRC1成分复杂、存在多个亚型，目前对PRC1各亚型在植入前胚胎发育过程中的具体功能及调控机制尚不清楚。通过分析人类及小鼠植入前胚胎转录组数据，我们发现PCGF1作为母源因子，在植入前胚胎发育早期表达丰度显著高于其它同家族蛋白，提示PCGF1在植入前胚胎中可能具有重要功能，可能参与形成主要的母源PRC1亚型，即PRC1.1。利用Morpholinos敲低PCGF1在植入前胚胎中的表达，小鼠胚胎囊胚形成率显著降低，部分胚胎阻滞在2-细胞阶段，提示PCGF1可能参与了ZGA过程。进一步，我们利用CRISPR/CAS9基因编辑技术建立了PCGF1敲除小鼠胚胎干细胞株，并分析了敲除PCGF1对下游基因表达的影响。结果表明，在胚胎干细胞中敲除PCGF1有868个基因表达显著下调，只有140个基因表达上调，说明PCGF1对下游基因的表达主要起激活作用。值得注意的是，在敲除PCGF1下调的基因中存在113个ZGA相关基因，包括Zscan4a/b/c/d/f。进一步生信分析发现敲除PCGF1后表达量下调的重复元件主要为LTR（80.81%），包括MERVL、ERVL、MT2等，提示PCGF1可能通过上调LTR重复元件的活性调控ZGA相关基因的表达。利用ChIP-seq研究发现，敲除PCGF1后PRC2核心组分Ezh2及H3K27me3在下游基因的富集增强，尤其是敲除PCGF1下调的基因，说明PCGF1可能通过竞争性抑制PRC2的富集维持下游基因的表达活性。本研究揭示了PCGF1在早期胚胎发育中的作用及具体分子调控机制，为人类早期胚胎发育异常患者的诊疗提供理论支持。