花生转录因子AhNAC2调控AhNCED1基因表达和响应水分胁迫研究

在前期工作证明耐旱花生品种AhNAC2高表达，转录因子AhNAC2可提高拟南芥的抗旱性，同时发现ABA合成关键酶AhNCED1基因受AhNAC2的直接调控，其调控区含有潜在的AhNAC2结合反应元件的基础上。本项目进一步探讨AhNAC2在花生响应水分胁迫过程中的作用；研究AhNAC2是否通过调节ABA合成关键基因AhNCED1表达，影响花生响应水分胁迫的能力；明确AhNAC2在花生响应胁迫反应中调控AhNCED1表达的功能, 包括AhNAC2与AhNCED1启动子顺式作用元件的结合方式及激活作用，以及AhNAC2转录活性的关键氨基酸基序。本项目探讨AhNAC2在花生响应水分胁迫和调控AhNCED1转录水平，促进ABA合成，提高花生抗旱性的分子机理，为阐明AhNAC2在花生脱落酸信号传导途径中的作用，为耐旱花生品种的分子育种提供理论依据和策略。

花生响应水分胁迫耐旱生理变化和器官AhNAC2 的mRNA水平和蛋白表达变化一致；叶和根中AhNAC2基因表达升高。AhNAC2蛋白被PEG诱导表达。花生干旱后再复水AhNAC2蛋白表达下降。干旱2到10h，叶片AhNAC2蛋白表达量持续累积，AhNCED1表达量下降；35S::AhNAC2-GFP转基因毛状根中AhNCED1表达明显低于对照，说明AhNAC2及蛋白累积与AhNCED1表达下降呈负相关。. AhNAC2融合蛋白结合AhNCED1启动子F（1~456 bp）和M（457~891 bp)，在植物体内结合AhNCED1启动子F区结合效率比M高。AhNAC2蛋白N端1-186aa是核定位和转录抑制AhNCED1启动子活性的关键区域。AhNAC2基因N4定位在细胞核，具有转录活性。转基因p35S::AhNAC2纯系的GUS活性低于pAhNCED1::GUS植株，前者体内胁迫相关基因RD29A, RD29B, RAB18, AtMYB2, AtMYC2, ERD1, COR47, COR15a, KIN1, AREB1, CBF1和 AMY1表达相对上调，这些基因的启动子包含多个NACRE元件，表明AhNAC2基因通过激活了下游胁迫相关基因表达，提高了植株的抗逆境能力。将AhNCED1启动子分成9段，原生质体瞬时表达实验结果表明，水分胁迫下AhNAC2直接结合AhNCED1基因启动子P4区域的NACBS，抑制AhNCED1表达。转基因AhNCED1::GUS株系干旱处理后，其GUS活性明显高于35S::AhNAC2 / AhNCED1::GUS株系.AhNAC2对AhNCED1基因负调节作用部分依赖于其启动子P4区域的NACBS。. ABA加强了在干旱条件下AhNAC2对AhNCED1的负调节，外源ABA未增强AhNAC2对AhNCED1启动子的结合，而ABA合成抑制剂FLU处理明显降低了与启动子结合。AhNAC2通过与AhNCED1启动子元件结合调控AhNCED1转录，转录因子AhAREB1具有协同作用。经ABA处理花生，AhNAC2主要结合AhNCED1的N2段，AhAREB1则结合pN3段，AhNAC2和AhAREB1直接互作。发现ABA影响AhNAC2蛋白的稳定性。