PpDAM5基因的功能分析及其调控桃芽休眠解除的分子机制研究

Dormancy which determines the mature period is a frequently studied field in facilities cultivation of peach, and chilling requirement directly affects the dormancy release. Our preliminary study shows that the candidate gene PpDAM5 is located nearby the most significant signal of chromosome 1 by GWAS analysis on chilling requirement character, and yeast single hybridization test shows that PpDAM5 can directly bind PpbZIP transcription factor PpABI5 promoter. On the basis of these preliminary finds, we further try to characterize the molecular function and mechanism of PpDAM5 in dormancy release using exogenous hormones ABA and its inhibitors; According to the phenotype of bud and seed germination of transgenic plants, the biological function of PpDAM5 in the dormancy release of peach bud will be determined; we will conduct the yeast double hybridization, CO-IP, Pull-down test, to screen and identify interactor with PpDAM5 protein; and the downstream target genes of PpDAM5 will to be screened and validated by yeast single hybridization, EMSA and double fluorescent enzyme technique to establish signaling pathway of PpDAM5 in the dormancy release of peach bud. The mechanism of PpDAM5 interacting with PpbZIPs in dormancy release of peach bud will be studied, this will enrich the theoretical knowledge of dormant molecular biology of peach.

休眠是桃设施栽培熟期调控的科学问题，需冷量高低直接影响休眠解除。前期我们对桃需冷量性状开展GWAS分析发现，PpDAM5位于一号染色体显著信号峰内，是需冷量性状候选基因；酵母单杂交试验表明PpDAM5能够绑定PpbZIP转录因子PpABI5的启动子。本项目在此基础上，利用外源激素ABA及其抑制剂，进一步开展PpDAM5的功能验证及PpDAM5调控休眠解除的分子机制研究。检测PpDAM5表达模式，根据转基因植株芽及种子萌发表型，明确PpDAM5在桃芽休眠解除中的生物学功能；通过酵母双杂交、Co-IP、pull-down试验，筛选、鉴定与PpDAM5互作的蛋白；利用酵母单杂交、EMSA、双荧光素酶技术筛选并验证PpDAM5下游靶基因PpbZIPs，建立PpDAM5参与调控桃芽休眠解除的信号途径。通过PpDAM5介导PpbZIPs调控桃芽休眠解除机制的研究，旨在丰富桃休眠分子生物学理论基础。

休眠是桃设施栽培熟期调控的科学问题，需冷量高低直接影响休眠解除。前期研究发现PpDAM5是需冷量性状候选基因；以十年生‘春雪’毛桃花芽为试材，从生理和分子水平研究了PpDAM5调控休眠的机制。主要研究结果如下：.（1）我们首先根据‘春雪’桃需冷量累积和花芽萌发率，对花芽休眠进程进行了划分。自10月15日至12月10日处于自然休眠期，11月15日至12月10日处于自然休眠解除期（过渡期），12月10日之后处于生态休眠期。.（2）对PpDAM5进行了休眠期表达量的分析发现，PpDAM5在自然休眠期表达量达到最高，在11月15日之后下调，即在自然休眠解除期下调。ABA处理抑制了花芽萌发，并上调了PpDAM5的表达。过表达株系PpDAM5-OE表现出抑制萌发的表型。通过酵母双杂交筛选，我们在桃中分离了与PpDAM5蛋白相互作用的蛋白PpBT3。对PpBT3组织特异性表达分析发现，PpBT3在茎和种子中的表达量显著高于其他部位，另外PpBT3在雌蕊和萼片中的表达量相对高于其他组织。在拟南芥中过表达PpBT3促进种子发芽，降低AtSVP表达，在PpDAM5-OE株系中也发现了抑制ATBT3基因表达的现象。在含有1μM ABA的MS板上，PpBT3-OE具有明显的抑制ABA促进发芽的抗性。另外，qRT-PCR实验表明，PpBT3的转录水平在自然休眠解除期逐渐增加，这与PpDAM5表达模式的趋势相反，表明PpBT3通过与PpDAM5相互作用调节桃芽的自然休眠解除。.（3）通过酵母双杂交筛选，我们分离了与PpDAM5蛋白相互作用的PpCMB1。对PpCMB1进行了花的组织特异性分析，发现PpCMB1主要在雌蕊和心皮中表达。将PpCMB1在拟南芥中的过表达，PpCMB1-OE具有显著的促进早花的表型。我们的研究结果表明PpCMB1促进了早花的功能在桃中生态休眠结束后，PpCMB1可能通过与PpDAM5的相互作用促进开花。. （4）酵母单杂交实验证明PpTCP20能够结合到PpDAM6基因的启动子。EMSA实验表明PpTCP20结合PpDAM5和PpDAM6基因启动子中的GCCCR顺式作用元件；瞬时双荧光素酶实验表明，PpTCP20蛋白抑制PpDAM5和PpDAM6的表达。过表达PpTCP20的转基因烟草种子的萌芽率明显高于对照。此外，PpTCP20转基因烟草开花时间明显早于野生型。