柽柳 bHLH 转录因子响应盐胁迫的基因表达调控研究

bHLH is a kind of important transcription factor, which play important role in growth and stress tolerance of plants. A bHLH gene had been cloned and characterized from Tamarix hispida, and was transformed into Arabidopsis plants. The transgenic Arabidopsis plants overexpressing bHLH displayed significant improved stress tolerance; meanwhile, besides binding to G-box, this bHLH is found to also bind to W-box, LTRE1 and LTRE15. Additionally, the binding affinities of bHLH to W-box, LTRE1 and LTRE15 are induced, while the binding of bHLH to G-box is not responding to salt stress. These results indicated that W-box, LTRE1 and LTRE15 play roles in stress response mediated by bHLH. Based on these studies, the distribution and occurrence of the motifs of G-box, W-box, LTRE1 and LTRE15 in the promoters of genes targeted by bHLH will be compared between under normal and salt stress conditions using ChIP-Seq analysis. These results are combined with ChIP quantitative PCR to reveal the functional roles of these motifs in the gene expression regulation of bHLH. The pathways and processes involved in these motifs will be further studied. The protein partners interacted with bHLH will be studied using Co-Immunoprecipitation, and the effects of the motif binding caused by the interaction of bHLH with other proteins are further investigated. These studies together will reveal the salt stress tolerant mechanism mediated by bHLH.

bHLH是一类重要的转录因子，在植物生长发育及抗逆调控中起重要作用。我们从柽柳中克隆了一个bHLH基因，其在拟南芥中过表达显著提高了转基因植物的耐盐性。除结合G-box外，bHLH还特异性地结合W-box、LTRE1和LTRE15元件，且在盐胁迫下对这三种元件的结合力显著增强，而对G-box的结合则不受盐胁迫调控，提示这三个元件在逆境下bHLH对基因的调控中起作用。因此，我们拟通过ChIP-Seq比较盐胁迫和非胁迫下这些元件在bHLH调控基因的启动子中分布和出现频率，并结合ChIP定量PCR分析，阐明这些元件在bHLH调控基因表达中的功能，并进一步揭示它们控制的基因所涉及的生物过程及途径。利用免疫共沉淀技术确定与bHLH互作的蛋白，并进一步研究bHLH与这些蛋白互作后对顺式作用元件结合的影响，进而阐明bHLH调控基因表达来响应逆境胁迫的机理。

bHLH (basic/helix-loop-helix)转录因子在植物非生物逆境应答过程中起重要作用。前期研究表明ThbHLH1在拟南芥中过表达显著提高了其耐盐及抗旱能力。本研究从ThbHLH1上游调控因子，识别的顺式作用元件，调控的下游靶基因以及互作蛋白等层面系统阐述了ThbHLH1转录因子在调控植物抗逆过程中的作用机制，并取得了预期的成果。.首先，利用瞬时转化柽柳及基因枪转化洋葱表皮的方法进行亚细胞定位研究，结果鉴定ThbHLH1是一个核定位蛋白，其蛋白的表达也受盐和干旱胁迫诱导。利用酵母单杂交及ChIP-PCR，鉴定出ThDof16为ThbHLH1的上游调控因子；ThbHLH1能够特异识别LTRE15 (CCGAC)元件，并且在盐和渗透胁迫下，ThbHLH1通过结合LTRE15来激活基因表达的能力显著增强。利用RNA-seq及ChIP-PCR鉴定出6个ThbHLH1直接调控的靶基因。通过酵母双杂交鉴定出ThbHLH23，ThWRKY11及ThWRKY12为ThbHLH1的互作蛋白，且ThbHLH1能与ThbHLH23和ThWRKY11形成异源二聚体进而增强对LTRE15元件的识别能力。通过稳定转化获得过表达ThbHLH1的转基因拟南芥，通过对转基因及野生型拟南芥表型及抗逆生理指标分析，表明过表达ThbHLH1基因增强了拟南芥的耐盐及抗渗透胁迫能力。利用瞬时转化的方法分别获得ThbHLH1过表达、抑制表达及对照(转空载体)柽柳转基因植株，并进一步利用功能获得及缺失的方法研究ThbHLH1基因在调控柽柳耐盐及抗渗透胁迫的功能。研究结果表明：ThbHLH1的表达能够提高植物的耐盐、抗旱能力，ThbHLH1通过调控一些抗逆生理途径中的一些关键基因(如：P5CS，BADH/ALDH，POD和SOD)的表达，来提高甜菜碱和脯氨酸的含量，提高过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，并降低细胞内活性氧(ROS)的积累，进而增强其抗逆能力。.这些研究表明，ThbHLH1通过与LTRE15元件结合来调控与抗逆相关基因的表达，这些基因的表达提高了植物的渗透势，增强了ROS清除能力，进而来提高植物耐盐及抗渗透胁迫的能力。本研究进一步丰富了木本植物bHLH转录因子响应非生物胁迫的研究，同时为林木抗性分子育种提供了优良的抗性基因。