Swiprosin-1在血脑屏障通透性调节中的作用及其机制研究

Our previous studies found that swiprosin-1,a novel calcium- binding protein,was highly expressed in brain microvascular endothelial cell of mice. Over-expression of swiprosin-1 in bEnd.3 significantly increased cell permeability and decreased the expression of the tight junction protein ZO-1, suggesting that swiprosin-1 may play an important role in regulation of blood-brain barrier (BBB) permeability. However the mechanisms of swiprosin-1 in regulation of BBB permeability are still unclear. To further demonstrate that swiprosin-1 involves in regulation of BBB permeability, the localization of swiprosin-1 in specialized sites within brain microvascular endothelial cell, the effect of swiprosin-1 on the concentration of intracellular Ca2+ and the cell permeability are intended to detect. To explore the mechanisms of swiprosin-1 in regulation of BBB permeability, the expression and function of tight junction protein when over-expression of swiprosin-1 in bEnd.3 is intended to examine. Moreover,the effect of swiprosin-1 on BBB permeability is intended to observe by changing the concentration of extracellular and intracellular Ca2+. Furthermore,the inflammation-induced BBB permeability is planned to investigate in swiprosin-1 knock-out mice. Our studies will contribute to clarify the mechanism of BBB permeability regulation, to find the potential targets for therapeutic intervention tight junctions, and provide a theoretical basis for design novel tight junction modulators.

我们前期研究发现一种新型钙蛋白swiprosin-1 在小鼠脑微血管内皮细胞上高表达；对 bEnd.3 细胞过表达swiprosin-1 基因，细胞通透性明显增加，胞质附着蛋白ZO-1 明显减少，表明 swiprosin-1 可能是调节血脑屏障（BBB）通透性的重要蛋白。但 swiprosin-1调节BBB通透性的作用机制尚不清楚。本项目拟进一步观察 swiprosin-1 在 BMEC 中的亚细胞定位，对细胞内钙离子浓度及细胞通透性的影响，进一步明确其在BBB通透性调节中的重要作用；通过观察 swiprosin-1 对BBB紧密连接蛋白的作用、参与胞内钙离子调节及对炎症诱导的BBB损伤的调节，从而明确 swiprosin-1 调节BBB通透性的作用机制。本项目的开展，将有助于完善BBB通透性调节机制的阐明，发现调控细胞紧密连接新的分子靶点，为设计新型紧密连接调节药物提供一定的理论基础。

血脑屏障(BBB)主要由脑微血管内皮细胞构成，主要功能为限制物质进出中枢神经系统(CNS)，保持CNS内环境的稳定。BBB通透性功能破坏在几乎所有的CNS疾病中有所发生。此外，研究如何可控增加BBB通透性，使药物进入CNS从而治疗疾病具有重要意义。因此，寻找新型调节BBB通透性的靶点具有重要意义。. 我们采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型（MCAO）导致BBB通透性增加，与LPS致BBB通透性增加，以及冷冻损伤致BBB通透性增加这三种方法进行了比较，发现尽管MCAO造模时间较长，手术操作更复杂，但是MCAO术后BBB破坏部位比较局限，功能破坏比较适合，术后24h死亡率较低，比较下来，MCAO致BBB通透性增加这种方法更稳定、更可靠、最适合，从而为后续的研究提供了很好的模型。. Swiprosin-1是2004年首次报道发现的小分子量蛋白，目前关于该蛋白的研究主要集中见于B淋巴细胞、T淋巴细胞等免疫细胞调节方面，该蛋白在其他方面作用知之甚少。我们发现小鼠大脑皮质表达swiprosin-1，其主要集中表达于脑微血管内皮细胞中。Swiprosin-1敲除鼠在MCAO造成的BBB通透性增高模型中大脑中伊文思蓝渗出较野生型显著减少；而过表达鼠生理状况下则可增加伊文思蓝在BBB的通透性。整体动物过表达swiprosin-1后，大脑皮质中紧密连接蛋白occludin与ZO-1的表达下调，并伴有分布连续性的破坏。而在另外一方面，我们检测了MCAO术后swiprosin-1敲除鼠大脑皮质中梗死区域occludin与ZO-1表达，发现其表达下调情况与野生型鼠相比减轻。此外，我们发现在过表达鼠大脑皮质中ROCK-1含量较野生型小鼠表达量高。而与此同时，我们在swiprosin-1野生型鼠MCAO术后同样发现，梗死侧ROCK-1表达增加，而在swiprosin-1敲除型鼠中则没有发现这种现象。. 总之，本研究首次明确了swiprosin-1在脑微血管中的表达；证实了swiprosin-1在BBB通透性调节中的重要作用；同时该作用是通过影响紧密连接蛋白occludin、ZO-1的表达水平及分布情况起作用；ROCK-1通路在swiprosin-1调节BBB通透性过程中起到了关键作用。本研究为寻找影响BBB通透性的新靶点奠定了坚实的基础。