花生NAC类转录因子AhNAC4响应干旱胁迫的分子机理研究

干旱严重影响花生的产量和品质。提高花生的抗旱性，在促进我国花生产量的提高，保证国民食用油安全等方面具有重大的战略和现实意义。初步分析表明花生AhNAC4为NAC类转录因子，受干旱胁迫诱导表达。本研究拟详细分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下的表达水平，明确其时空表达模式和胁迫响应类型；通过在花生中抑制表达和过量表达该基因，分析转基因后代在干旱条件下的表型和生理生化指标，明确其功能；利用蛋白质组学技术分析转基因后代和野生型之间的差异表达蛋白，明确AhNAC4影响的下游蛋白；获得该基因的抗体，利用染色质免疫沉淀和下一代测序（CHIP-seq）技术分析AhNAC4调控的下游基因，从而揭示其响应干旱胁迫的分子机理，为培育抗旱花生新品种或新种质储备基因资源。

花生是我国重要的油料作物，在我国食用油供给体系中占据重要位置。据统计，我国70%的花生受到不同程度的干旱威胁，每年因干旱引起的减产达30%-50%。此外，干旱还是加剧花生收获前黄曲霉污染的最主要原因，严重影响花生果仁和花生油的品质。NAC转录因子是植物特有的转录调控因子，研究表明，NAC转录因子在防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发挥重要作用。本研究在前期已经分离到花生AhNAC4基因，并证明其为转录因子。.本项目主要研究AhNAC4在植株不同部位和不同胁迫处理下的时空表达情况；构建AhNAC4基因的抑制表达和过量表达载体并转化花生和烟草，通过对转基因植株的干旱耐受性、不同胁迫处理下的表型和生理指标变化的研究，明确AhNAC4转录因子的功能；利用染色质免疫沉淀和下一代测序（CHIP-seq）技术和RNA-seq技术分析AhNAC4调控的下游基因；利用蛋白质组学技术分析AhNAC4调控的下游基因和蛋白。本研究发现AhNAC4转录因子主要在花生的花和种子中表达，同时受干旱、盐渍和ABA处理诱导表达。进一步分析发现，干旱胁迫处理2-6h时，AhNAC4的表达量较高。我们分别获得了过量表达AhNAC4的烟草和花生转基因纯合体。在干旱胁迫处理下，过量表达花生AhNAC4的转基因烟草叶片的气孔关闭数目增多，蒸腾速率和气孔导度下降，水分利用效率提高，脯氨酸、丙二醛和可溶性蛋白含量提高，离体叶片后期的失水速率下降，进而抗旱能力显著增强。利用RNA-seq技术分析了AhNAC4调控的下游基因，结果发现1995个差异表达基因，其中上调表达的有392个，下调表达有1603个。这些差异表达基因参与蛋白、核酸、糖和脂类等生物大分子代谢、能量代谢和次生代谢等过程。利用双向电泳分析了AhNAC4调控的下游蛋白，结果发现40个差异表达蛋白，利用肽质量指纹对差异蛋白进行鉴定，受花生蛋白数量和EST序列较少影响，仅有5个差异蛋白得到鉴定。本研究结果表明花生AhNAC4转录因子受干旱诱导表达，过量表达AhNAC4转录因子，提高了转基因烟草对干旱的耐受性。通过本项目的实施，获得了转基因抗旱花生新种质，为培育抗旱和农艺性状优良的花生新品种奠定基础。