花生抗旱相关AREB转录因子的功能研究

前期工作表明AhNCED1调节花生在水分胁迫下ABA合成，其启动子具有多个ABRE。花生叶片接受水分胁迫信号后，在转录水平上如何调节AhNCED1等基因的表达影响抗旱性不清楚。本项目从花生耐旱品种克隆AhAREB基因全长，证实其编码AhAREB蛋白，受干旱和ABA诱导。探讨花生在水分胁迫下以及对水分胁迫敏感的发育时期AhAREB转录因子的表达特性，明确AhAREB的转录活性和转录激活关键区域，分析AhAREB转录因子是否通过与AhNCED1启动子的顺式作用元件ABRE的特异结合，以及拟南芥异源表达恢复同源基因突变体abi5的表型及抗旱生理变化, 研究AhAREB在花生耐旱品种应答水分胁迫、在转录水平调控ABA合成和诱导相关基因表达、促进植物抗旱性的功能，以及可能作用模式。为今后了解花生接受干旱信号到脱落酸合成基因和诱导基因表达期间的信号传导提供基础，为开展花生分子标记辅助育种提供依据。

从耐旱花生品种克隆AhAREB1及其上游序列，全长cDNA为1814 bp，有3个内含子和4个外显子。上游启动子序列为1060 bp. 经SA、GA3和ABA外施处理，以及脱水和 PEG等胁迫皆诱导AhAREB1表达。该基因编码的AhAREB1蛋白显示AREB/ABF亚家族特征，有4个保守结构域和一个bZIP的DNA结合结构域；AhAREB1与大豆GmAREB1、番茄SlAREB和拟南芥ABF2/AREB1同源性高；蛋白N端的C2保守域为最关键的转录激活区域，C4抑制其自身的转录活性；转pBI121-AhAREB1-GFP拟南芥植株中AhAREB1亚细胞定位于细胞核中，酵母杂交实验证实其具有转录活性。35S::AhAREB1（编码全长蛋白）和35S::△AhAREB1（编码蛋白N端缺失了55个氨基酸）转化拟南芥同源基因缺失突变体abi5-1，能恢复对ABA的敏感性，且△AhAREB1/abi5-1ABA产生互补生理表型。随着异源AhAREB1表达量增加，转基因植株抗旱能力增强。p35S::△AhAREB1 /pAhNCED1::GUS/Col和p35S::AhAREB1/Ws/pAhNCED1::GUS/Col植株的各发育时期GUS 活性比各自对照植株均显著下降，说明△AhAREB1和AhAREB1分别转入pAhNCED1::GUS/Col和pAhNCED1::GUS /Ws后，特异结合AhNCED1基因，抑制了启动子的表达，其中△AhAREB1的抑制作用更强，ABA或脱水处理对启动子结合的抑制程度不同，转△AhAREB1或AhAREB1的拟南芥在不同发育阶段对启动子结合抑制有差异。超表达AhAREB1拟南芥植株抗旱性增强，对ABA的敏感性提高。对超表达AhAREB1植株全基因组表达芯片分析结果表明，胁迫相关基因RD20, RD26, RD29 B, RD29A和ABA信号负调控AZF1上调表达；植株体内SOD和CAT显著提高，控制了活性氧水平；ABA生物合成关键酶基因NCED表达增强，ABA降解重要酶基因CYP707A2表达降低，ABA水平维持一定水平。推测AhAREB1通过控制植物体内活性氧含量和ABA稳态水平提高拟南芥植株的抗旱性。上述结果进一步认识AhAREB1的功能提供依据。