Retromer复合物调控稻瘟病菌致病分子机制的研究

In eukaryotic cells, the retromer complex has been shown to mediate retrieval of various transmembrane receptors from endosomes to the trans-Golgi network for maintenance of a normal physiological cycle. Rice blast disease, caused by Magnaporthe oryzae, is highly important in economic significance. It is necessary to further understand the molecular mechanism of pathogenesis in Magnaporthe oryzae. In our preliminary work, we found that there is retromer complex mediating protein sorting system in Magnaporthe oryzae and confirmed that it plays a key role in fungal pathogenesis by molecular analysis. This project will first define the sublocalization of the retromer complex, the function of every subunits and their interaction. Moreover, we will illuminate the association of retromer complex with its regulation protein Rab7 and autophagy network, screen and identify retromer complex mediated specific cargoes in Magnaporthe oryzae via high throughput technique. Finally we will systematically reveal molecular mechanism of pathogenesis regulated by the retromer complex in the fungus. We expect that these results will help in-depth for our understanding the function of retromer complex in plant pathogenic fungi, at the same time, it will provide new theoretical basis for better control of the rice blast disease.

真核生物的retromer复合体能介导多种受体蛋白从早期内涵体逆向转运到高尔基体网络中，维持正常的生理循环过程。稻瘟病菌引致水稻稻瘟病具有重要经济意义，从分子水平上加深认识稻瘟病菌致病过程的机制十分必要。我们前期研究发现，稻瘟病菌中存在retromer复合体介导的蛋白分拣系统，且证实其功能的发挥是稻瘟病菌成功致病的关键因素。本项目拟在研究明确retromer复合体亚细胞定位, 各个亚基的功能和相互作用的基础上；阐明retromer复合体与调控蛋白Rab7和细胞自噬调控网络的关系，以及用高通量的方法筛选鉴定retromer介导的特异转运受体，系统地阐明retromer调控稻瘟病菌的致病机理，该研究结果不仅能深化我们对retromer复合体在病原真菌中作用机制的认识，同时可以为稻瘟病菌的防治提供新的理论依据。

真核生物中retromer介导蛋白质从反向高尔基体到内涵体的逆向运输，本项目首先系统研究了稻瘟病菌retromer复合体生物学功能，发现retromer受体-选择性亚单位 (MoVps35/MoVps26/MoVps29)对稻瘟病菌附着胞介导的侵染起着至关重要的作用，MoVPS35基因缺失阻碍了糖原降解、脂质体转运，延迟了细胞核降解及附着胞内膨压的产生。细胞学分析表明，MoVps35-GFP和自噬相关蛋白RFP-MoAtg8在自噬体外围动态共定位，RFP-MoAtg8与MoVps35-GFP互作，MoVps35功能受损使RFP-MoAtg8不能从自噬体回收进而影响自噬体的形成；表明retromer受体-选择性亚单位是稻瘟病菌自噬介导的侵染所必需。retromer的MoVps17对稻瘟病菌的生长发育及侵染致病也起着至关重要的作用，而MoVPS5基因缺失可能是致死的。通过亲和纯化和质谱联用技术，我们筛选到400个MoVps35可能的互作蛋白，包括Rab、SANRE、Clathrin、马达蛋白和细胞骨架蛋白，进一步的功能研究还在深入开展；酵母双杂交实验表明MoVps35可以与MoRab7互作，可能说明Vps35介导的细胞自噬受Rab7的调控。.为了明确Retomer在丝状真菌中的功能重要性之普遍性，我们进一步研究其在禾谷镰刀菌中的功能。发现FgVps35在细胞中以囊泡的形式快速转运，并与早期内涵体，晚期内涵体和TGN marker共定位，表明FgVps35在禾谷镰刀菌中以液泡膜作为供体膜并以囊泡的形式向TGN（trans-Golgi network）进行运转，而这一转运依赖于微管蛋白。FgVPS35、FgVPS26、FgVPS29、FgVPS5和FgVPS17基因敲除导致禾谷镰刀菌生长、产孢、致病性和子囊孢子的产生均受到影响。酵母双杂交实验表明retromer复合体各个成员FgVps35、FgVps26、FgVps29、FgVps17 和 FgVps5之间存在互作关系。表明禾谷镰刀菌中retromer复合体通过介导细胞内转运事件调控生长发育及致病性。.总结起来，该项目研究结果为阐释retromer复合体在丝状病原真菌中调控生长发育和侵染致病机制奠定了基础，为进一步制定合理的防治策略提供理论依据。